京大戟醋制前后大戟二烯醇和甘遂甾醇的變化

曹雨誕， 耿欣欣， 陳海鷹， 張 麗

(南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210046)

京大戟為大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥根［1］，具有瀉水逐飲、消腫散結的功效。其性寒，味苦，有毒;由于其生品毒性較大，故臨床上常用其炮制品。歷版中國藥典均采用醋制來降低京大戟的毒性［2］，但有關其醋制減毒的物質基礎研究報道相對較少。有研究表明，京大戟根中二萜、三萜類成分可能為其毒性成分［3］，而大戟二烯醇和甘遂甾醇均為三萜類成分［4］。因此本實驗以京大戟中指標性成分大戟二烯醇［5］和甘遂甾醇為指標，采用高效液相色譜法［5-6］考察京大戟醋制前后大戟二烯醇和甘遂甾醇的變化，為進一步研究京大戟醋制減毒物質基礎和作用機理提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜系統(tǒng) (2489紫外/可見檢測器，Empower色譜工作站)，FW-100高速萬能粉碎機 (天津市泰斯特儀器有限公司)，FA1104N電子天平 (d=0.1mg，上海精密科學儀器有限公司)，DL—I—15臺式封閉電爐 (天津市泰斯特儀器有限公司)，BP211D電子天平 (d=0.01mg，德國賽多利斯)，KQ—500型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)，HH-S恒溫水浴鍋 (江蘇國勝實驗儀器廠)，Anke TGL—16B型離心機 (上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥 京大戟藥材采購自安徽省亳州市藥材總公司，經南京中醫(yī)藥大學樂巍副教授鑒定為大戟科植物大戟 Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥塊根。京大戟生品 (取生京大戟飲片，除去雜質，大小分檔，打粉);京大戟醋制品 (取生京大戟數個，大小分檔后，加30%量食醋拌勻，浸潤;加入純凈水，文火煮沸，煮至醋被吸盡;取出，室溫晾干，40℃烘箱干燥;打粉)。

大戟二烯醇和甘遂甾醇對照品 (自制，純度經HPLC歸一化法測定大于98%)，乙腈 (色譜純)，甲醇 (色譜純)，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent XDB C8色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水 (93 ∶7)，體積流量 1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒定質量的大戟二烯醇對照品52.44 mg和甘遂甾醇對照品21.32 mg，分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得對照品貯備溶液。再分別精密吸取上述對照品貯備溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取京大戟生品和醋制品粉 (過65目篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理 (功率250 W，頻率50 kHz)40 min，再次稱定，用乙酸乙酯補足損失的質量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉移至10 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取上述混合對照品溶液1、2、5、10、20 μL，按 2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積值Y為縱坐標，進樣量X為橫坐標，繪制標準曲線，分別計算大戟二烯醇和甘遂甾醇回歸方程:Y=394058.8X－38209.7(r=0.9999)，Y=174098.5X+30030.5(r=0.9998)。結果表明大戟二烯醇在進樣量0.5244～10.4880 μg范圍內，甘遂甾醇在進樣量0.2132～4.264 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，重復進樣6次，按2.1項下色譜條件，測定峰面積，結果大戟二烯醇和甘遂甾醇的RSD分別為0.62%和0.45%，表明該方法的精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取京大戟醋制品約0.5 g，平行6份，按照2.3項下方法制備供試品溶液，依法測定，得大戟二烯醇和甘遂甾醇的RSD分別為0.83%和0.72%。結果表明該方法的重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一京大戟醋制品供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h進樣測定，得大戟二烯醇和甘遂甾醇峰面積的RSD分別為1.28%和1.26%，表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的醋制京大戟粉末6份，每份0.25 g，精密加入對照品貯備溶液各0.5 mL，按2.3項下制成供試品溶液，依法測定，計算回收率。得大戟二烯醇的加樣回收率為97.36%，RSD為1.07%;甘遂甾醇的加樣回收率為98.72%，RSD為0.77%。結果見表1和表2。

表1 大戟二烯醇的加樣回收率試驗Tab.1 Recovery test of euphol

表2 甘遂甾醇的加樣回收率試驗Tab.2 Recovery test of tirucallol

2.5 樣品測定 取京大戟生品和京大戟醋品按2.3項下供試品溶液的制備方法依法制備，以平均峰面積，采用標準曲線法利用回歸方程計算大戟二烯醇和甘遂甾醇的含有量，測定結果見表3。

表3 京大戟醋制前后大戟二烯醇和甘遂甾醇的比較(n=3)Tab.3 Comparison of euphol and tirucallol contents for crude Euphorbiae Pekinensis Radix before and after processing with vinegar(n=3)

3 討論

3.1 根據相關文獻 ［5-7］，選擇了不同溶劑 (甲醇﹑乙醇及乙酸乙酯)超聲提取，同時又考察了提取時間，結果表明，樣品用乙酸乙酯超聲提取40 min效果最佳。

3.2 由于大戟二烯醇和甘遂甾醇在210 nm處有最大吸收，故檢測波長選擇為210 nm，使得各成分在其最大吸收波長下進行測定，從而提高了分析精度，保證了方法穩(wěn)定性。采用Agilent XDB C8色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水、甲醇-水為流動相，按不同比例進行測定，發(fā)現以乙腈-水 (93∶7)色譜系統(tǒng)能把大戟二烯醇與其同分異構體甘遂甾醇獲得較好的分離效果。

3.3 有研究表明，大戟二烯醇對人正常肝細胞和人正常胃黏膜上皮細胞均有一定的增殖抑制作用［8］，當京大戟醋制后其含有量略有降低［9-10］。本實驗考察了京大戟醋制前后三萜類成分大戟二烯醇和甘遂甾醇的變化，結果發(fā)現大戟二烯醇和甘遂甾醇經醋制后含有量都有降低，這可能是由于在醋制過程中加入了水，加速了萜類化合物的分解，降低了京大戟的毒性。上述實驗結果為后續(xù)京大戟醋制減毒物質基礎和作用機理的深入研究提供了依據。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:208.

［2］張樂林，孫立立.京大戟現代研究概述［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2011，29(3):577-579.

［3］Singh G B，Singh S，Sharma M L，et al.Hypotensive activity of 8，24-euphadien-3β-ol(euphol)［J］.Planta Medica，1989，55(6):500.

［4］梁僑麗，戴傳超，吳啟南，等.京大戟的化學成分研究［J］.中草藥，2008，39(12):1779-1781.

［5］麻風華，姜文紅，哈麗麗，等.RP-HPLC法測定京大戟中大戟二烯醇的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30(12):2290-2292.

［6］高 羽，梁僑麗，戴傳超，等.大戟屬4種植物中大戟二烯醇的含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(5):1051-1052.

［7］李 媛，張 麗，單鳴秋，等.正交試驗優(yōu)選甘遂醋制最佳工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(7):4-6.

［8］ 李征軍.甘遂化學成分及毒性評價研究［D］.南京:南京中醫(yī)藥大學，2012:58-61.

［9］曹雨誕，陳海鷹，顏曉靜，等.不同醋制法對京大戟中大戟醇含量的影響［C］.中華中醫(yī)藥學會中藥炮制論文集，貴州，2011:197-201.

［10］邱韻縈，郁紅禮，吳 皓，等.京大戟和甘遂炮制前后大戟二烯醇的含量比較［J］.中國藥房，2012，23(11):1031-1033.