黃芩解毒顆粒提取工藝研究

王洛臨，施之琪，李智勇，陳玉興

(廣東省中醫(yī)研究所廣東 廣州 510095)

黃芩解毒顆粒提取工藝研究

王洛臨，施之琪，李智勇，陳玉興

(廣東省中醫(yī)研究所廣東 廣州 510095)

目的優(yōu)選黃芩解毒顆粒的提取工藝。方法以解熱、抗炎藥效為指標(biāo)，對本處方的提取工藝路線進(jìn)行初步篩選，根據(jù)藥效篩選結(jié)果，采用正交試驗設(shè)計，以揮發(fā)油得量為指標(biāo)，對加水量、浸泡時間和蒸餾時間進(jìn)行優(yōu)選;以干浸膏得量和黃芩苷含有量的綜合評分值為指標(biāo)，對加水量、提取時間和提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果提取工藝路線采用雙提法最好，揮發(fā)油提取最佳工藝為加12倍水，提取6 h;水提取最佳工藝為提取3次，每次加8倍水，提取1 h。結(jié)論選擇的提取工藝路線有效，優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

黃芩解毒顆粒;抗炎;解熱;提取工藝;揮發(fā)油;黃芩苷;正交試驗

黃芩解毒顆粒由黃芩、魚腥草、虎杖、辛夷等藥材組成，具有清熱解毒、清肺解表的功效，臨床用于治療由病毒感染等引起的疾病。為確定合理的提取工藝，保證制劑質(zhì)量和療效，以解熱、抗炎藥效為指標(biāo)，對提取工藝路線進(jìn)行初步篩選，根據(jù)篩選結(jié)果，確定提取工藝路線。提取工藝以魚腥草、辛夷揮發(fā)油得量，君藥黃芩中黃芩苷含有量和水提干浸膏得量為評價指標(biāo)，采用正交試驗設(shè)計法，確定本品的揮發(fā)油提取工藝和水提取的工藝條件。

1 實驗儀器、動物與試藥

1.1 儀器Agilent1100高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器、二元泵;Bp211D電子分析天平(德國);RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海);MYB型調(diào)溫電熱套(浙江);ZK－82A真空干燥箱(上海)。

1.2 動物SPF級NIH小鼠和SPF級SD大鼠(體質(zhì)量為180～220 g)均由廣東省實驗動物中心購得。

1.3 試藥黃芩苷對照品(批號:111595－200604)購于中國藥品生物制品檢定所;銀翹解毒片(規(guī)格:0.52 g，佛山徳眾藥業(yè)有限公司，批號:11001);去痛片(規(guī)格:365 mg，湖北華中藥業(yè)有限公司，批號:20101159);黃芩解毒顆粒所用藥材均由廣東養(yǎng)和醫(yī)藥有限公司購得，經(jīng)筆者鑒定均符合2010年版《中國藥典》一部各項下有關(guān)規(guī)定;所用化學(xué)試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝路線的確定據(jù)文獻(xiàn)［1－7］報道，處方中藥材含有揮發(fā)油、黃酮、皂苷、生物堿和多糖等成分，根據(jù)各類成分的理化性質(zhì)，按下列擬定的提取工藝方案制備供試品樣品，并分別進(jìn)行抗炎、解熱藥效學(xué)比較，確定本品的提取工藝路線。

2.1.1 方案1按處方比例稱取處方各藥材，分別加入藥材量10倍水提取1次，每次2 h，濾過，提取液合并，濃縮成1 g浸膏含1.02 g藥材的浸膏，作為樣品1，備用。

2.1.2 方案2按處方比例，取魚腥草、辛夷藥材，照《中國藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油提取法，加入藥材量10倍水提取揮發(fā)油，揮發(fā)油與藥液另存，藥渣加入其余處方量藥材，分別加入藥材量10倍量60%乙醇提取回流2次，每次2 h，濾過，提取液合并，加入提取揮發(fā)油后的藥液，濃縮成1 g浸膏含0.97 g藥材的浸膏，加入揮發(fā)油，作為樣品2，備用。

2.1.3 方案3按處方比例，取魚腥草、辛夷藥材，照方案2揮發(fā)油提取方法提取揮發(fā)油，揮發(fā)油與藥液另存，藥渣加入其余藥材，分別加10倍水提取2次，每次2 h，提取液合并，加入提取揮發(fā)油后的藥液，濃縮成1 g浸膏含1.07 g藥材的浸膏，加入揮發(fā)油，作為樣品3，備用。

2.1.4 方案4按處方比例，取處方藥材照方案3方法提取、濃縮成1 g浸膏約相當(dāng)于1 g藥材的浸膏，加入95%乙醇至藥液含乙醇量為60%，靜置24 h，濾過，上清液回收乙醇并濃縮成1 g浸膏含1.21 g藥材的浸膏，加入揮發(fā)油，作為樣品4，備用。

2.1.5 對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響［8］取SPF級NIH小鼠100只，隨機分為對照組、銀翹解毒片和各提取工藝樣品高、中劑量組，每組10只，各給藥組按劑量灌胃給藥，對照組給予等體積蒸餾水，每天1次，共7 d，末次給藥后1 h，每鼠右耳前后兩面涂二甲苯0.04 mL，2 h后處死動物，剪取對稱左右耳片，用8 mm打孔器沿左右耳郭相同部位打孔，分別迅速稱質(zhì)量，以兩耳質(zhì)量差為腫脹度指標(biāo)，并以各組腫脹度的均值計算腫脹抑制率。結(jié)果見表1。

結(jié)果顯示，各工藝樣品對小鼠耳廓腫脹抑制率比較，以樣品3最好。

2.1.6 對內(nèi)毒素所致大鼠高熱的影響［8］取SPF級SD大鼠若干，于室溫(20±2)℃的實驗室內(nèi)飼養(yǎng)3 d后，每日測肛溫2次，選一日內(nèi)體溫變化不超過0.4℃的大鼠120只，雌雄各半，隨機分為正常對照組、模型對照組、銀翹解毒片組、去痛片組和各提取工藝樣品高、中劑量組，每組10只。各給藥組按劑量灌胃給藥，給藥體積為10 mL/Kg，每天1次，連續(xù)5 d，對照組、模型對照組同法給予等體積的蒸餾水。末次給藥前各組動物禁食不禁水24 h，末次給藥30 min后，對照組腹腔注射生理鹽水5 mL/Kg，其余各組大鼠均腹腔注射內(nèi)毒素150 μg/Kg，注射容積5 mL/Kg，于致熱攻擊后1、2、4 h各測體溫1次。結(jié)果見表2。

表1 不同工藝樣品對抑制小鼠耳腫脹度的作用(±s，n=10)

表1 不同工藝樣品對抑制小鼠耳腫脹度的作用(±s，n=10)

注:與對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別劑量/(g生藥·kg－1)耳廓腫脹度/g腫脹抑制率/%對照組等體積15.550±4.85－銀翹解毒片組0.8116.510±4.42＊＊58.14樣品1高劑量組17.428.106±2.75*47.87樣品1中劑量組8.719.002±3.16*42.11樣品2高劑量組17.428.372±2.97*46.16樣品2中劑量組8.7112.740±7.3218.07樣品3高劑量組17.426.192±4.16＊＊60.18樣品3中劑量組8.719.408±3.71*39.50樣品4高劑量組17.428.745±3.47*43.76樣品4中劑量組8.7110.263±4.99*34.00

表2 不同工藝樣品對內(nèi)毒素所致大鼠高熱的影響(±s，n=10)

表2 不同工藝樣品對內(nèi)毒素所致大鼠高熱的影響(±s，n=10)

注:與正常對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別劑量/(g生藥·kg－1)實驗前大鼠體溫/℃造模后不同時間大鼠體溫/℃1 h2 h4 h正常對照組等體積37.49±0.2437.41±0.2837.52±0.3137.27±0.28模型對照組等體積37.29±0.2639.03±0.43＊＊39.48±0.49＊＊38.94±0.51＊＊銀翹解毒片組0.56237.40±0.2938.55±1.1038.68±0.58##38.59±0.35樣品1高劑量組13.5037.34±0.2338.87±0.3838.55±0.43##38.83±0.48樣品1中劑量組6.7537.42±0.3238.55±0.4938.31±0.50##38.51±0.40樣品2高劑量組13.5037.34±0.2238.42±0.3638.33±0.25##38.72±0.15樣品2中劑量組6.7537.43±0.2538.66±0.4138.50±0.40##38.67±0.22樣品3高劑量組13.5037.26±0.2038.04±0.49##38.07±0.25##38.65±0.29樣品3中劑量組6.7537.17±0.1638.41±0.7238.34±0.56##38.78±0.21樣品4高劑量組13.5037.39±0.3038.59±0.3638.42±0.30##38.72±0.27樣品4中劑量組6.7537.32±0.3138.97±0.8138.49±0.60##38.66±0.44去痛片組0.5437.34±0.3038.02±0.41##37.76±0.26##38.27±0.37#

結(jié)果顯示，與模型對照組比，各樣品高、中劑量組2h和樣品3提取物高劑量組1h均有明顯的解熱作用，其作用以樣品3最好。

2.2 黃芩苷的測定方法［9］

2.2.1 色譜條件AgilentExteng XDB－C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)PN990967－902;流動相為甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.2);柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;檢測波長280 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取在60℃減壓干燥4 h的黃芩苷對照品2.845 mg，至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即每1 mL含56.9 μg的溶液，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別量取對照品溶液1、3、5、8、10、12 μL按上述條件進(jìn)樣，測得峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=2.815 324 8X+2.102 921，相關(guān)系數(shù)r=0.999 99。表明黃芩苷的量在56.9～682.8 ng之間范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 供試品溶液的制備精密移取水提取液4 mL，置50 mL量瓶中，加入76%乙醇定容，搖勻，靜置24 h，精密量取上清液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.5 測定方法分別精密吸取對照品溶液2 μL、10 μL和供試品溶液各5 μL注入液相色譜儀，測定，計算提取液中黃芩苷的含有量。

2.2.6 精密度試驗精密吸取供試品溶液5 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測得峰面積積分值RSD為0.48%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗分別精密吸取同一份供試品溶液5μL，分別于0、2、4、6、8、12 h按上述色譜條件進(jìn)樣，測得峰面積積分值RSD為0.46%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗取同一濃縮液樣品，分別按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液5份，按上述色譜條件進(jìn)樣5 μL，測得峰面積，計算含有量RSD為0.92%。

2.2.9 回收率試驗取已知含有量濃縮液樣品9份，分別精密加入一定量的黃芩苷對照品，按上述供試品制備與測定方法進(jìn)行測定，計算黃芩苷檢出量，測得黃芩苷平均回收率為98.06%，RSD為1.14%。

2.2.10 陰性對照試驗按處方比例，稱取除黃芩藥材外的各味藥材，分別加10倍水，煎煮兩次，每次2 h，減壓濃縮至500 mL，按上述供試品溶液的制備方法制備陰性供試品溶液。按上述方法測定，結(jié)果表明，陰性對照溶液在黃芩苷相應(yīng)位置無吸收，處方中其它藥味對本測定無干擾。

2.3 干浸膏量的測定精密吸取濃縮液50 mL，置已恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，照干燥失重測定法(《中國藥典》2010年版一部附錄IX G)測定，計算干浸膏質(zhì)量。

2.4 揮發(fā)油提取工藝優(yōu)選照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩD揮發(fā)油測定法甲法提取揮發(fā)油，以揮發(fā)油總質(zhì)量為考察指標(biāo)，對影響提取較大的浸泡時間、加水量和蒸餾時間進(jìn)行考察研究，各因素水平見表3。

表3 揮發(fā)油提取因素水平

2.4.1 正交試驗按處方比例，稱取魚腥草和辛夷藥材9份，每份330 g，照L9(34)正交設(shè)計試驗表安排試驗，分取揮發(fā)油，加0.5 g無水硫酸鈉脫水，過濾，用約5 mL乙醚洗滌容器及硫酸鈉，揮發(fā)油轉(zhuǎn)移至已恒質(zhì)量的稱量瓶中，40℃揮干乙醚，稱質(zhì)量，結(jié)果見表4、表5。

結(jié)果表明:因素A和因素C對實驗結(jié)果影響顯著，各因素的主次順序為C＞A＞B，C因素2、3水平間無顯著差別，最優(yōu)提取工藝確定為藥材加12倍水，回流提取6 h;即A2B1C2。

表4 揮發(fā)油提取工藝正交實驗結(jié)果

表5 方差分析

2.4.2 驗證試驗按處方比例取魚腥草、辛夷藥材，共3份，按優(yōu)選的工藝條件提取揮發(fā)油。3次試驗揮發(fā)油得率分別為0.179%、0.176%、0.176%，平均0.177%，表明該工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。

2.5 水提取工藝優(yōu)選以黃芩苷含有量和干浸膏得量的綜合評分值為指標(biāo)，對影響藥材水提取的加水量、煎煮時間和煎煮次數(shù)進(jìn)行考察研究，因素水平見表6。

表6 因素水平

2.5.1 正交試驗按處方比例，稱取黃芩等藥材9份，每份204 g，按正交實驗表L9(34)安排試驗。濾過，提取液合并，濃縮并定容至500 mL，既得。測定干浸膏得量(X1)和黃芩苷含有量(X2)。按公式Y(jié)=［(X1i/X1max)×0.4+(X2i/X2max)×0.6)］×100計算綜合評分值，以綜合評分值計算正交試驗結(jié)果，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7、表8。

結(jié)果表明，因素主次為提取次數(shù)(C)＞加水量(A)＞提取時間(B)。因素C和因素A對試驗結(jié)果有影響。最佳工藝為:分別加藥材量8倍水提取3次，每次1 h，即A2B1C3。

2.5.2 驗證試驗按最佳水提取工藝條件重復(fù)試驗3次，結(jié)果表明，平均干浸膏得率為26.58%，RSD為1.10%。黃芩苷平均質(zhì)量濃度為7.518 mg/mL，RSD為1.89%。計算黃芩苷的平均提取率為87.65%(處方中黃芩藥材含黃芩苷總量為4 285.8mg)，平均綜合評分值為98.33，與正交試驗綜合評分最大值之間接近，表明該工藝合理、穩(wěn)定、可靠。

表7 正交設(shè)計試驗結(jié)果

表8 方差分析

3 討論

3.1 中藥復(fù)方成分復(fù)雜，其效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)是復(fù)方所含的全成分［10］，同一處方不同提取工藝所產(chǎn)生效應(yīng)物質(zhì)之間的比例不同，產(chǎn)生藥效作用的強弱也不相同。藥效試驗結(jié)果表明，本方提取工藝路線以揮發(fā)油提取優(yōu)于不提取工藝，水提取優(yōu)于醇提取或水提醇沉工藝，提示，處方中揮發(fā)油為有效成分之一，多糖類等醇中溶解度低的物質(zhì)可能也是有效成分之一。

3.2 黃芩為方中君藥，選用黃芩苷作為提取評價指標(biāo)之一，分析方法成熟，分析結(jié)果可靠。經(jīng)揮發(fā)油提取和水提取工藝驗證表明，優(yōu)化的工藝參數(shù)穩(wěn)定、可靠、有效，為本制劑的下一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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R284.2

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1001－1528(2012)10－2028－04

2012－04－21

王洛臨(1958—)，男，主任中藥師，從事中藥新藥研發(fā)與工藝研究。Tel:(020)83501292，E－mail:luolin_w@163.com