活血消癭片水提液的澄清工藝研究

胡俊杰， 肖 伊， 呂秋霞， 鄭國華*

(1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北武漢430065;2.孝感市南區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，湖北孝感432300)

活血消癭片是湖北省中醫(yī)院根據(jù)國家名老中醫(yī)陳如泉教授的經(jīng)驗方研制而成的醫(yī)院制劑，由桃仁、莪術、柴胡、王不留行、貓爪草等八味中藥組成，具有活血通絡、消癭化結之功效，臨床上主要用于結節(jié)性甲狀腺腫［1］。為將其開發(fā)成現(xiàn)代中成藥，有效控制該制劑的質量，保證其臨床療效，減少服用量，本試驗以浸膏得率和苦杏仁苷含有量為評價指標，對活血消癭片水提液澄清工藝進行了研究。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀 (四元泵、紫外檢測器及配套色譜工作站);ZK072型電熱真空干燥箱 (上海市儀器試驗總廠);Mettler-Toledo AG285型分析天平 (Mettler-ToledoGmbH，Laboratory＆ Weighing Technologies，Switzer-land);DZHW型調(diào)溫電熱套 (北京市永光明醫(yī)療儀器廠);HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 (國華電器有限公司);KH-400-FDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器 (昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)?？嘈尤受諏φ掌?(中國藥品生物制品檢定所批號:110820-200403)，甲醇、磷酸為色譜純，水為自制重蒸水，其余試劑均為分析純。處方中各藥材經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學生藥學教研室鑒定均為正品。

2 評價指標

以浸膏得率和苦杏仁苷含有量作為澄清工藝篩選的考察指標。

2.1 浸膏得率的測定 精密量取提取液25 mL，置于已干燥至恒質量的蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干后，置真空干燥箱中，60℃恒溫減壓干燥36 h至恒質量，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算，即得。

浸膏得率 =(浸膏質量 /原藥材的質量)×100%

2.2 苦杏仁苷測定［2］

2.2.1 色譜條件 Aichrom Bond-AQ C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長210 nm，柱溫30℃，流動相甲醇-0.1%磷酸 (20∶80)，體積流量1 mL/min。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒質量的苦杏仁苷對照品6.45 mg，置25 mL量瓶中加70%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，配成質量濃度為0.258 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備與測定 精密量取提取液5 mL，水浴揮干，殘渣用70%甲醇溶解并轉移至25 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，超聲5 min，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，代入線性回歸方程，計算，即得。

2.2.4 標準曲線的建立 精密量取對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，置5 mL量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測定。以峰面積積分值 (Y)對進樣量 (X)進行線性回歸，得回歸方程為:Y=877.4376X－8.6077，r=0.99998。結果表明，苦杏仁苷在0.258～2.580 μg的范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密量取同一對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積積分，結果RSD為0.61%(n=6)，表明儀器精密度較好。

2.2.6 回收率實驗 采用加樣回收法取樣品6份，精密加入苦杏仁苷對照品溶液適量，測定峰面積積分，結果苦杏仁苷平均回收率為98.38%，RSD為1.06%(n=6)。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 對同一供試品溶液分別在0、3、6、9、24 h進樣，測定其峰面積積分。結果RSD為1.21%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取同一批樣品6份，按2.2.3項下方法制備與測定。結果RSD為0.51%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.2.9 空白試驗 以缺桃仁藥材的空白樣品按供試品溶液的制備與測定，結果見圖1，在與苦杏仁苷相同位置無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對照試驗對本品的測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

3 實驗方法和結果

3.1 藥材原提取液的制備與各指標的測定 取莪術、柴胡提取完揮發(fā)油后的濾渣與桃仁、王不留行、貓爪草按處方比例混合，按最佳水提工藝 (加8倍量水、浸泡0.5 h、提取3次、每次1.5 h)要求制得水提液，備用。測得浸膏得率為21.69%;浸膏中苦杏仁苷質量分數(shù)為1.58%(n=3)。

3.2 乙醇沉淀法［3］為了除去雜質并最大限度地保留有效成分，減小服用劑量，在濃縮的水提液中加入適量乙醇以除去其中的淀粉、樹膠等多糖類和蛋白質等雜質，采用單因素試驗對醇沉過程中的主要影響因素 (藥液濃縮比例、醇沉濃度)進行考察。

3.2.1 藥液濃縮比例的考察 取水提液，分別濃縮成 (生藥∶水 =g∶mL)2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2，加入95%乙醇，邊加邊攪拌，使醇沉濃度達到80%，4℃靜置24 h，濾過。濾液按2.1項和2.2項下方法測定浸膏得率和苦杏仁苷含有量，計算浸膏中苦杏仁苷含有量，結果見表1。

表1 藥液濃縮比例的考察結果 (n=3)

表1結果表明:隨著藥液濃縮比例的減小，浸膏得率和苦杏仁苷總量增加，而浸膏中苦杏仁苷的含有量先增大后減小，當藥液濃縮成 (m生藥∶V水)為1∶1時，浸膏中的苦杏仁苷含有量最高，因此我們選擇藥液濃縮比為1∶1。

3.2.2 醇沉濃度的考察 取m生藥∶V水=1∶1(g∶mL)水提濃縮液，分別加入95%乙醇適量，邊加邊攪拌，使各濃縮液醇沉體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%，4℃靜置24 h，濾過。濾液按2.1項和2.2項下方法測定浸膏得率和苦杏仁苷含有量，計算浸膏中苦杏仁苷含有量，結果見表2。

表2 不同濃度醇沉澄清的考察結果 (n=3)

由表2可見，隨著醇沉體積分數(shù)的增大，浸膏得率減小，苦杏仁苷總量和浸膏中苦杏仁苷的含有量增大，并結合實際生產(chǎn)的需要，我們選擇醇沉體積分數(shù)為80%。

3.3 殼聚糖澄清技術［4-6］殼聚糖澄清技術為近年來發(fā)展起來的一種新的中藥純化方法，具有來源廣泛、毒副作用小、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。因此我們考察了藥液濃縮比例、殼聚糖的濃度、殼聚糖的用量、澄清溫度等因素對水提液澄清效果的影響。

3.3.1 藥液濃縮比例的考察 取水提液，分別濃縮成m生藥∶V水(g∶mL)為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，放冷至室溫，分別于攪拌下按0.8 mL/(g生藥)的量加入新鮮配制的1%的殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌10 min，靜置12 h，濾過。濾液按2.1項和2.2項下方法測定浸膏得率和苦杏仁苷含有量，計算浸膏中苦杏仁苷含有量。結果見表3。

表3 藥液濃縮比例的考察結果 (n=3)

由表3可見，苦杏仁苷總量和浸膏中苦杏仁苷的含有量隨著藥液濃縮比例減小先增大后減小，當藥液濃縮比例為m生藥∶V水=1∶8時，苦杏仁苷總量和浸膏中苦杏仁苷的含有量均到達最大值，因此選擇藥液濃縮比例為m生藥∶V水(g∶mL)=1∶8。

3.3.2 殼聚糖溶液濃度的考察 取水提液，濃縮至m生藥∶V水(g∶mL)為1∶8，放冷至室溫，分別于室溫攪拌下加入配好的0.25%、0.5%、1.0%的殼聚糖溶液，至溶液中有絮狀沉淀產(chǎn)生，繼續(xù)攪拌10 min，靜置12 h，濾過。濾液按2.1項和2.2項下方法測定浸膏得率和苦杏仁苷含有量，計算浸膏中苦杏仁苷含有量。結果見表4。

表4 殼聚糖溶液濃度的考察結果 (n=3)

由表4可知，殼聚糖溶液質量分數(shù)為0.5%時，苦杏仁苷總量和浸膏中苦杏仁苷的含有量較高，而且在實驗過程發(fā)現(xiàn)，常用的1%殼聚糖溶液較為黏稠，溶脹時間長，也不方便操作，因此我選擇殼聚糖溶液質量分數(shù)為0.5%。

3.3.3 殼聚糖用量的考察 取水提液，濃縮至m生藥∶V水(g∶mL)為1∶8，放冷至室溫，分別于室溫攪拌下按0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL/(g生藥)的量加入新鮮配制的0.5%殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌10 min，靜置12 h，濾過。濾液按2.1項和2.2項下方法測定浸膏得率和苦杏仁苷含有量，計算浸膏中苦杏仁苷含有量。結果見表5。

表5 殼聚糖用量的考察結果 (n=3)

表5結果表明:苦杏仁苷總量和浸膏中苦杏仁苷的含有量隨著殼聚糖用量的增加先增大后減小，當殼聚糖的用量為1.2 mL/(g生藥)時，苦杏仁苷的含有量均到達最大值，因此選擇殼聚糖的用量為1.2 mL/(g生藥)。

3.3.4 殼聚糖澄清溫度的考察 取水提液，濃縮至m生藥∶V水(g∶mL)為1∶8，分別于室溫25℃、水浴40℃ 、50℃、60℃、70℃攪拌條件下按1.2 mL/(g生藥)量加入新鮮配制的0.5%殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌10 min，靜置12 h，濾過。濾液按2.1項和2.2項下方法測定浸膏得率和苦杏仁苷含有量，計算浸膏中苦杏仁苷含有量。結果見表6。

表6 殼聚糖澄清溫度的考察結果 (n=3)

表6表明:苦杏仁苷總量和浸膏中苦杏仁苷的含有量隨著澄清溫度的升高而緩慢增大，實驗中澄清時間也隨著溫度升高而縮短，溫度升高到70℃時苦杏仁苷的含有量有下降的趨勢，從節(jié)省澄清時間和操作方便考慮，我們最終選擇澄清溫度為60℃。

3.3.5 澄清靜置時間的考察 取水提液，濃縮至m生藥∶V水(g∶mL)為1∶8，分別于水浴60℃攪拌下按1.2 mL/(g生藥)量加入新鮮配制的0.5%殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌10 min，分別靜置4、8、12、16、24 h，濾過。濾液按2.1項和2.2項下方法測定浸膏得率和苦杏仁苷含有量，計算浸膏中苦杏仁苷含有量。結果見表7。

表7 澄清靜置時間的考察結果 (n=3)

表7表明:苦杏仁苷總量和浸膏中苦杏仁苷的含有量隨著澄清靜置時間的延長而增大，到達靜置12 h時，含有量基本持平，為了節(jié)約時間，我們最終選擇澄清靜置時間為12 h。

3.4 殼聚糖澄清技術與醇沉工藝的比較

3.4.1 醇沉處理液與殼聚糖澄清劑處理液的制備 精密量取3份1∶1的活血消癭片水提濃縮液，加乙醇使含醇量達80%，攪勻，靜置12 h，濾過，得醇沉的處理液。精密量取3份1∶8的水提濃縮液，在水浴60℃條件下，按1.2 mL/(g生藥)的量加入0.5%的殼聚糖溶液，靜置12 h，濾過，得殼聚糖澄清液。

3.4.2 固形物保留率、苦杏仁苷保留率的比較 取水提液及以上兩種純化后的處理液，按2.1項和2.2項下方法測定浸膏得率和苦杏仁苷含有量，計算浸膏中苦杏仁苷含有量。結果見表8。

表8 殼聚糖澄清技術與醇沉工藝的比較結果 (n=3)

4 討論

4.1 將殼聚糖澄清技術與醇沉工藝結果進行比較，殼聚糖澄清技術處理的樣品苦杏仁苷保留率及浸膏保留率均比醇沉工藝高，溶液也較澄清;醇沉工藝處理的樣品浸膏中苦杏仁苷含有量比殼聚糖澄清技術處理的樣品高0.23%，相差不大?？紤]到水提醇沉這一中藥制藥傳統(tǒng)工藝，其存在成本高、成品穩(wěn)定性差、生產(chǎn)周期長、勞動強度高等缺點，而且在醇沉過程中，易于把中藥中的無機成分、部分多糖除去，難以保證制劑的有效性。研究已證實了中藥所含微量元素與藥效、藥性、歸經(jīng)及臨床療效之間存在密切聯(lián)系，不能忽視中藥所含微量元素的作用［7］;過去被認為是雜質的多糖類也已被證實具有增強免疫作用和多種生物活性［8］，我們最終選擇殼聚糖澄清技術作為活血消癭片水提液的澄清工藝。

4.2 絮凝澄清法是在中藥提取液或提取濃縮液中加入一種澄清劑以吸附架橋及電中和方式除去溶液中的粗粒子，以達分離純化的目的。絮凝劑的種類很多，有殼聚糖、鞣酸、明膠、101果汁澄清劑、ZTC澄清劑等，但目前應用最廣泛的是殼聚糖澄清劑。殼聚糖為甲殼類動物、昆蟲和其他無脊椎動物外殼中的甲殼質脫乙?；频?，是生物界唯一的聚陽離子多糖。殼聚糖可明顯使帶負電性懸浮顆粒反應后凝集、沉淀，去除藥液中的較大顆粒提高制劑穩(wěn)定性及澄明度［9］。

4.3 本實驗根據(jù)組方中主要有效成分和可量化指標，特選苦杏仁苷含有量、浸膏得率作為澄清效果指標，以保證篩選結果的客觀準確。

4.4 苦杏仁苷的測定采用高效液相色譜法，經(jīng)方法學考察，除陰性無干擾和線性好外，精密度高，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及回收率均較好，其操作簡便、靈敏，測得結果準確。

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