藏藥吉堪明目液毒理研究

紅 梅，劉有菊，陳秋紅

（1.青海省藏醫(yī)藥研究院 藥物研究所，青海 西寧 810003；2.青海高原醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 中心實驗室，青海 西寧 810012）

吉堪明目液系小檗眼藥膏的基礎(chǔ)上改變劑型的制劑，原方收載于貢智云丹嘉措的《臨床札記·札記精粹》（藏文版），原藏名音譯為“目曼接堪”［1］（我們簡稱為 MMJK），至今已有一百多年的臨床應(yīng)用史，現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標準·藏藥》（第一冊）［2］，是歷代藏醫(yī)用于治療眼科炎癥和視力模糊等眼部疾病代表性外用藥物。為了臨床使用方便，我們用現(xiàn)代工藝改進為滴劑。本文主要闡述其毒理學(xué)研究，為新藥安全性評價和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 藥物

吉堪明目液由本所工藝室提供，分裝于10mL的眼藥瓶中，每1mL相當于生藥材的0.52g。100℃滅菌30min，置4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動物

KM種小鼠，體重18～22g，清潔級，均由青海省實驗動物中心提供，合格證號：青醫(yī)動字第零零一號，家兔，普通級，2～2.5kg，合格證號：蘭大動檢（10）第034號。

1.3 儀器

電子天平、離心機、石蠟切片機、顯微鏡（北航醫(yī)學(xué)圖象分析管理系統(tǒng)）、全自動生化分析儀 Olympus au 640（日本）、血細胞分析儀Sysmex KX－21N（日本）、電子天平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

各項指標均用組間比較進行顯著性t檢驗，所有劑量資料以均數(shù)±標準差表示。

2 方法與結(jié)果

2.1 急性毒性實驗［3］

小鼠口服最大耐受量實驗：取健康KM種小白鼠60只，禁食16h后，灌胃給予吉堪明目液每1kg體重25mL，每隔6h同樣劑量灌胃給藥1次，24h共3次，總劑量為75mL體重1kg，相當于生藥39g／kg，空白組給予等體積賦形劑。觀察給藥后小鼠的毒性反應(yīng)，包括：一般癥狀、外觀、毛色、大小便、攝食情況、自主活動等，以及7d內(nèi)的死亡情況，并于給藥第7天稱重。見表1。

表1 給藥前后體重變化情況（）

組別 動物只數(shù) 給藥前（g） 給藥后（g）空白組10 18.14±0.67 21.08±1.5710 18.62±0.84 20.02±1.34吉堪明目液

由表說明吉堪明目滴眼液與空白組給藥前后體重?zé)o顯著性差異。

結(jié)果可見，小鼠給藥后自主活動、毛色、外觀、攝食量均正常，未見其他異常反映。在7d的觀察期內(nèi)未見有小鼠死亡，雌雄小鼠的體重均稍有增長和對照組無明顯差異，各組小鼠解剖經(jīng)肉眼觀察，給藥組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腸等臟器亦無明顯改變，和對照組相比無明顯差異。

2.2 刺激性實驗［4］

2.2.1 短期多次給藥眼刺激性實驗

健康無眼疾家兔3只，體重在2～2.5kg，3只家兔分別在左眼滴入吉堪明目液0.1mL，被動閉合10s，右眼滴入等體積賦形劑作為對照，各組均每15min點眼1次，連續(xù)給藥2h。記錄給藥后6、24、48、72h至7d觀察角膜、結(jié)膜、虹膜等部位的刺激反應(yīng)，直至停藥后一周，取眼球做病理檢查。結(jié)果見表2。

表2 吉堪明目滴眼液對兔眼刺激性評分（）

表2 吉堪明目滴眼液對兔眼刺激性評分（）

評價吉堪（15min／time，2h）組 3 左眼 均正常 0組別 動物只數(shù) 眼別 角、虹、結(jié)膜反應(yīng) 分值 眼刺激性無刺激性賦形劑對照組 3 右眼 均正常 0 無刺激性吉堪（3次／d，7d）組 3 左眼 均正常 0 無刺激性賦形劑對照組 3 右眼 均正常 0無刺激性

2.2.2 7天常規(guī)給藥眼刺激性實驗

健康無眼疾家兔3只，體重在2～2.5kg，分別在左側(cè)眼睛滴入吉堪明目液0.1mL，被動閉合10s，右眼滴入等體積賦形劑作為對照，每天3次，連續(xù)7天，實驗第2天起每日給藥前觀察角膜、結(jié)膜、虹膜等部位的刺激反應(yīng)，直至停藥后一周，取眼球做病理檢查。結(jié)果見表2。

結(jié)果可見：給予吉堪明目液3只短期多次和7d常規(guī)給藥未出現(xiàn)明顯的刺激反應(yīng)；結(jié)膜無充血、無水腫、無分泌物；角膜無混濁；虹膜正常。根據(jù)眼刺激實驗評分反應(yīng)分級均為0級，病理組織檢查，眼角膜實質(zhì)層和眼前房內(nèi)無炎癥反應(yīng)和其他改變。

2.3 長期毒性實驗

2.3.1 實驗方法

取健康無眼疾家兔32只，雌雄各半。體重2～2.5kg。按性別和體重隨機分空白對照組、吉堪明目大劑量（1g／mL）組、吉堪明目中劑量（0.52g／mL）組和吉堪明目小劑量組（0.26g／mL）4組，每組8只。給藥組雙眼滴受試藥0.1mL（2滴），每日4次，連續(xù)6周，空白對照組給等體積的賦形劑。30d后，將半數(shù)動物麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，按《新藥毒理學(xué)研究指導(dǎo)原則》（簡稱《指導(dǎo)原則》要求［5］，作血液學(xué)和生化指標測定，最后處死動物作尸檢，取臟器稱重和計算臟器系數(shù)，另外取眼球、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺及稱重并取病理組織切塊于4%甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋、纖維切片（4～6μm厚）、脫蠟水化、HE染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固后，光學(xué)顯微鏡下進行組織學(xué)觀察。剩余的家兔停藥，做延遲毒性檢測，繼續(xù)飼養(yǎng)觀察15d，然后分別測定生化和血液學(xué)各項指標并進行組織形態(tài)學(xué)觀察。主要觀察各組織有無細胞變性、炎癥和腫瘤的發(fā)生等病理學(xué)改變，并對典型病變予以照相記錄。實驗期間每天觀察記錄動物的外觀、雙眼、行為活動、飼料消耗以及糞便形狀、飲食量、飲水量變化，每周測量體重1次。

2.3.2 實驗結(jié)果

（1）吉堪明目液對長毒家兔行為、外觀等的影響：通過30d的實驗觀察表明，吉堪明目液各劑量組對家兔的毛色、尿色、糞便、活動情況、外觀、飲水和飲食量均無明顯影響，和對照組比較無明顯差異。

（2）吉堪明目液對長毒家兔體重的影響：實驗結(jié)果見表3、表4。結(jié)果表明：吉堪明目液各劑量組給藥30d、停藥15d，家兔體重與空白對照組比較無顯著差異。

表3 給藥期間家兔體重變化情況（）

表3 給藥期間家兔體重變化情況（）

注：給藥前以及給藥30d期間，各組n＝8；停藥15d期間，各組n＝4。

組別 劑量（g／mL） 給藥前 第1周 第2周 第3周對照組 0 2334.75±158.612413.75±122.24 2444.00±210.07 2492.25±46.063.16 2479.88±203.74吉堪高 1.1 2411.50±95.45 2512.63±70.03 2577.75±90.04 2641.38±109.71吉堪中 0.52 2401.75±82.66 2467.13±91.75 2531.38±103.31 2604.00±108.93吉堪低 0.26 2294.63±92.34 2360.63±75.04 2430.13±6

表4 給藥期間家兔體重變化情況（）

表4 給藥期間家兔體重變化情況（）

注：給藥30d期間，各組n＝8；停藥15d期間，各組n＝4。

組別 劑量（g／mL） 第4周 第5周 停藥1周 停藥2周對照組 2546.88±225.402621.63±251.01 2734.00±3036.71 2873.25±76.96.45 2828.00±325.96吉堪高 1.1 2716.13±131.202796.00±153.87 2909.75±172.88 3002.75±193.22吉堪中 0.52 2680.13±130.402759.63±150.49 2864.25±175.57 2957.50±196.82吉堪低 0.26 2571.50±41.92 2648.63±53.04 2777.25±5

（3）吉堪明目液對家兔大鼠臟器比重的影響：臟器體比系數(shù)：臟器質(zhì)量／體質(zhì)量×100%，實驗結(jié)果見表5、表6。

結(jié)果表明：吉堪明目液各劑量組給藥30d、停藥15d，家兔臟器系數(shù)未見明顯改變，和空白對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

（4）吉堪明目液對長毒家兔血液生化指標的影響：實驗測定了家兔血液ALT、AST、Cr、BUN、TP、ALB。結(jié)果見表7、表8。

結(jié)果可見，吉堪明目液各劑量組給藥30d后、停藥15d家兔血液生化各指標未見明顯的影響，和對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 給藥30d臟器體比系數(shù)變化情況（）

表5 給藥30d臟器體比系數(shù)變化情況（）

組別 心／體 肝／體 脾／體 肺／體 腎／體 腎上腺／體0.3930±0.03410.5856±0.06110.0215±0.0019吉堪高 0.2155±0.02292.8395±0.12720.0652±0.05590.3664±0.01990.5635±0.04150.0214±0.0018吉堪中 0.2240±0.02312.8463±0.11980.0774±0.00480.3636±0.02300.5363±0.02870.0215±0.0044吉堪低 0.2332±0.00792.8650±0.16610.0660±0.0161空白 0.2243±0.01212.8798±0.14020.0741±0.00410.3860±0.01130.6011±0.02530.0233±0.0018

表6 停藥15d臟器體比系數(shù)變化情況（）

表6 停藥15d臟器體比系數(shù)變化情況（）

組別 心／體 肝／體 脾／體 肺／體 腎／體 腎上腺／體0.3792±0.03870.5660±0.06880.0223±0.0028吉堪高 0.2111±0.02502.7449±0.11590.0848±0.00960.3555±0.01910.5453±0.04010.0217±0.0020吉堪中 0.2193±0.02062.7723±0.12540.0780±0.00480.3537±0.02180.5210±0.02850.0224±0.0044吉堪低 0.2240±0.00662.7396±0.18140.0717±0.0071空白 0.2183±0.01302.7626±0.18200.0829±0.01790.3690±0.01060.5746±0.02790.0224±0.0010

表7 給藥30d家兔的血液生化指標（）

表7 給藥30d家兔的血液生化指標（）

組別 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT（U／L）天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶COT（U／L）總蛋白TP（g／L）白蛋白ALB（g／L）肌酐Cr（μmol／dL）尿素氮（mmol／dL）4 153.75±3.77 4.18±0.25吉堪高 52.50±4.20 83.25±4.11 54.50±3.70 41.50±2.65 151.50±2.65 4.45±0.35吉堪中 52.75±3.30 80.75±2.50 54.75±1.71 42.00±2.94 152.00±3.16 4.48±0.42吉堪低 53.25±3.30 83.00±3.16 55.5±3.87 42.75±3.40空白 51.50±2.65 82.75±3.77 53.75±4.43 44.00±5.9152.75±4.11 4.38±0.33

表8 停藥15d家兔的血液生化指標（）

表8 停藥15d家兔的血液生化指標（）

組別 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT（U／L）天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶COT（U／L）總蛋白TP（g／L）白蛋白ALB（g／L）肌酐Cr（μmol／dL）尿素氮（mmol／dL）2 155.00±3.56 4.53±0.442 151.75±3.10 4.63±0.28吉堪高 53.75±4.57 80.50±3.11 52.25±2.63 41.50±2.65 151.50±3.11 4.58±0.33吉堪中 52.50±3.87 81.25±4.57 54.00±4.24 41.25±2.50 155.25±3.30 4.60±0.26吉堪低 55.25±3.86 83.75±4.57 53.75±4.03 42.00±3.9空白 55.50±1.29 79.25±5.44 53.50±3.11 43.25±2.2

（5）吉堪明目液對長毒家兔血象的影響：實驗測定了大鼠的 Hb、RBC、WBC、PC實驗結(jié)果見表9、表10。

結(jié)果表明：吉堪明目液各劑量組給藥30d、停藥15d，與對照組相比家兔血象無顯著差異（P＞0.05）。

表9 給藥30d家兔的血象變化（）

表9 給藥30d家兔的血象變化（）

組別 紅細胞（1012／L） 血紅蛋白（g／L） 血小板（109／L） 白細胞（109／L）35吉堪高 5.25±0.37 103.00± 2.58 641.00±2.58 17.30±0.37吉堪中 5.20±0.22 103.75±3.30 642.50±3.42 17.18±0.50吉堪低 5.18±0.41 102.50±1.29 642.67±2.65 17.10±0.空白 4.88±0.28 104.75±3.10 642.00±1.83 17.08±0.32

表10 停藥15d家兔的血象變化（）

表10 停藥15d家兔的血象變化（）

組別 紅細胞（1012／L） 血紅蛋白（g／L） 血小板（109／L） 白細胞（109／L）60吉堪高 5.13±0.17 103.25±0.96 642.50±3.42 17.48±0.56吉堪中 5.18±0.22 104.00±1.83 643.25±3.59 17.45±0.62吉堪低 5.15±0.21 106.75±1.71 643.50±3.51 17.55±0.空白 4.95±0.13 105.00±1.63 636.25±6.80 17.15±0.68

（6）吉堪明目液對長毒家兔主要器官組織形態(tài)學(xué)的影響：經(jīng)對全部抽取的256個器官組織的全面觀察，結(jié)果為：

眼球：64組眼球的角膜上皮細胞未見壞死脫落，角膜基質(zhì)層未見異物及血管，膠原纖維排列整齊，角膜內(nèi)皮完整；虹膜前緣層、基質(zhì)層和上皮層結(jié)構(gòu)清晰，其中瞳孔括約肌和開大肌排列整齊；睫狀體上皮、基質(zhì)和其中的睫狀體肌結(jié)構(gòu)如常；晶狀體表面薄層均質(zhì)狀晶狀體囊及單層立方狀上皮未見破環(huán)，深部晶狀體纖維排列整齊；視網(wǎng)膜色素上皮層、視細胞層、雙極細胞層和節(jié)細胞層厚度適中，排列整齊；視網(wǎng)膜外為脈絡(luò)膜和鞏膜，其結(jié)構(gòu)未見異常；眼球后方可見完整的視神經(jīng)。給藥組和對照組眼球各組織結(jié)構(gòu)均未見炎癥、異常增生和腫瘤性改變。

心：32組心臟的心外膜、心肌膜和心內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，心肌細胞無肥大及萎縮，心肌膜內(nèi)肌原纖維排列整齊，橫紋明顯，心外膜的間皮細胞、心內(nèi)膜的內(nèi)皮細胞和心肌細胞均未見明顯的變性、壞死和增生，心臟各層間質(zhì)均未見炎癥細胞浸潤。

肝：32組肝組織，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈位于小葉中央，周邊肝細胞索呈放射狀規(guī)則排列，肝血竇無明顯縮窄或增寬，肝細胞未見明顯的氣球樣變性、脂肪變性和嗜酸性變；未見區(qū)帶狀壞死、碎屑樣壞死；未見肝細胞淤膽和膽栓形成。未見內(nèi)皮細胞、枯否氏細胞增生。匯管區(qū)無擴大，未見纖維組織增生。

脾：32組脾臟被膜未增厚，脾小梁未增寬，分布規(guī)則及均勻，紅髓、邊緣區(qū)和白髓結(jié)構(gòu)清楚，脾血竇無擴張及淤血，淋巴小結(jié)未增多，生發(fā)中心大小適中。

肺：32組肺組織肺泡大小一致，肺泡間隔薄厚適中，無纖維組織增生，無血管擴張充血和水腫，細支氣管及其周圍、肺泡內(nèi)和肺泡間隔未見明顯的炎癥細胞浸潤和其它炎性滲出物。

腎：32組腎臟被膜厚度適中，皮質(zhì)和髓質(zhì)界限清楚，腎小球未見萎縮或代償性肥大，近曲小管和遠曲小管上皮細胞未見細胞水腫（顆粒變性）、透明變性和壞死，集合管各屬支和腎間質(zhì)均未見炎癥反應(yīng)。

腎上腺：32組腎上腺被膜完整，皮質(zhì)和髓質(zhì)界限分明，球狀帶、束狀帶和網(wǎng)狀帶分層清楚，均未見明顯的變性、壞死、增生和炎癥細胞浸潤。

3 結(jié)論

本藏藥是由小檗膏、訶子、紅花、冰片、熊膽粉、麝香組成，有消炎止痛的作用，用于目赤癢痛、流淚、沙眼等眼病。臨床效果肯定，西藏自治區(qū)藏醫(yī)院對米乃剛擦（眼部干澀癥）臨床病歷統(tǒng)計30例，眼部點小檗眼藥膏，每天4次。結(jié)果：痊愈30例，總有效率100%；對若日托嘛（視疲勞）病歷統(tǒng)計20例，患者眼部用小檗眼藥膏每天點5次。療程1周，結(jié)果：痊愈15例，好轉(zhuǎn)5例，總有效率90%。通過此項目支持改為滴劑后，觀察吉堪明目液對小鼠灌胃最大耐受量39g／kg未發(fā)生任何不良反應(yīng)；對家兔短期多次給藥眼刺激（1次／15min，連續(xù) 滴眼 2h）和常規(guī)治療7天（3 次／d，0.1mL／次）給藥刺激性試驗對兔眼觀察均無明顯影響，雙眼角膜透亮，無混濁，虹膜紋理清晰，結(jié)膜無充血，無水腫，無分泌物；病理組織檢查眼球角膜、虹膜、睫狀體、晶狀體、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)等組織結(jié)構(gòu)正常，無病理學(xué)改變；對家兔連續(xù)滴眼30天（4次／d）及停藥15天外觀行為、每周體質(zhì)量、血液學(xué)和血液生化學(xué)、臟器系數(shù)與空白組比較無明顯差異，病理檢測眼球角膜實質(zhì)層和眼前房內(nèi)無炎癥反應(yīng)和其他改變；心、肝、脾、肺、腎、腎上腺無明顯藥物性病變。綜上所述，本藏藥新制劑未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)，其臨床應(yīng)用安全，無刺激性。

［1］貢智云丹嘉措.《臨床札記·札記精粹》［M］.第1版.民族出版社，2005：146.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.藥品標準藏藥第一冊［S］.1995：266.

［3］徐叔云，等.藥理試驗方法學(xué)［M］.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：227－230.

［4］林琪玲.抗毒復(fù)命滴眼液的急性毒性與眼部刺激實驗研究［J］.深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，（18）4：212－214.

［5］中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.新藥（西藥）臨床前研究指導(dǎo)原則匯編（藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：198－208.