大鼠全腦缺血再灌注損傷后硫酸鎂及胞二磷膽堿的腦保護作用

西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內科（西安710003） 董亞茹 由鳳秋 楊 震

缺血后神經(jīng)保護劑的應用，已在腦缺血損傷治療上起到了重要的作用。聯(lián)合治療因其能應用不同神經(jīng)保護劑對缺血再灌注損傷后引起的瀑布式級聯(lián)反應的不同路徑起到阻止或延緩作用，而有很好的應用前景。我們通過對聯(lián)合應用硫酸鎂及胞二磷膽堿治療全腦缺血再灌注大鼠的研究，觀察缺血再灌注后大鼠神經(jīng)行為及海馬神經(jīng)元Bcl－2表達的變化，探討其治療效果。

材料及方法

1 材 料 兔抗鼠Bcl－2抗體及SABC免疫試劑盒；SD大鼠，280～320g，雄性，60只（西安交通大學實驗動物中心提供）。隨機分為：缺血組、硫酸鎂組、胞二磷組、聯(lián)合組，每組又分為1、3、7日組。動物單籠飼養(yǎng)，自由進食飲水。另外選2只大鼠不進行模型制作，作為正常對照組。

2 方 法 ①模型制作：采用改良的四血管阻塞法［1］制成大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350 mg/kg體重）腹腔注射后，俯位固定于立體定位儀上，頭向下屈曲30度暴露錐間隙后，于頸后第一、二頸椎處，切一長約2c m切口，分離頸部的肌肉，暴露第一頸椎上的雙側翼孔，插入雙極電凝器，燒凝其中走行的椎動脈，清潔、縫合傷口，置籠喂養(yǎng)。禁食，自由飲水。24h后同法麻醉動物，仰臥位固定后分離頸部肌肉，暴露雙側頸總動脈，動脈夾夾閉30 min后實現(xiàn)再灌注。假手術組僅暴露雙側翼孔及頸總動脈，各血管不行閉塞。觀察各組大鼠的意識、瞳孔、角膜反射、翻正反射等變化，并做記錄。模型成功標準［2］：雙側頸動脈夾閉后1 min內動物意識喪失；眼球變白，雙側瞳孔散大，對光反射消失；翻正反射消失。不符和上述標準者或再灌流期間出現(xiàn)全身強直、抽搐等異常發(fā)應者排除實驗。②治療方案：缺血結束后再灌注開始時即用藥，硫酸鎂組：硫酸鎂90 mg/kg腹腔注射；胞二磷膽堿組：胞二磷膽堿250 mg/kg腹腔注射；聯(lián)合組：硫酸鎂、胞二磷膽堿同上劑量腹腔注射，正常對照組及缺血組腹腔內注射生理鹽水1．5 ml，依次于同時間連續(xù)注射1、3、7日。③取材及制作標本：依各時間段在麻醉狀態(tài)下開胸經(jīng)左心室至主動脈插管，先用溫熱生理鹽水快速灌注300 ml左右，再以4%多聚甲醛灌注前固定，先快后慢，在開始的5 min灌注約200 ml，再根據(jù)動物肢體變硬狀況調整流速，使總灌注時間保證在30 min左右，然后斷頭取腦，于乳頭體及視交叉平面行冠狀切開，制成包含背側海馬的約4 mm厚的腦片，后固定48h后常規(guī)石蠟包埋、切片（厚約5μm）干燥。④HE染色：切片脫蠟至水蘇木素染5～10 min，鹽酸酒精分色后伊紅染3～5 min，脫水后封片、觀察。⑤Bcl－2免疫組化染色：干燥切片脫蠟至水，置入枸櫞酸鈉緩沖液（p H6．0）行微波抗原修復10 min，沖洗后滴加30g/L H2O2阻斷內源性酶15 min，沖洗5 min，分別滴加Bcl－2抗體10μl，4℃孵育過夜，PBS沖洗后，參照SABC試劑盒說明分別滴加二抗及SABC、DAB顯色液，脫水后封片、觀察。⑥神經(jīng)行為功能的觀察：利用美國弗尼吉亞大學顱腦損傷研究中心提供的評分方法檢測［3］。各組動物均在手術前3d進行行走訓練，并于缺血前1h測定其基礎值，缺血后連續(xù)測定，每組動物分別測兩次。行走實驗：觀察大鼠在寬2．5c m，長30c m的木條上行走情況，記錄通過所需時間。

3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件進行多組均數(shù)的方差分析和t檢驗。

結 果

1 HE染色 光鏡下，正常海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量多，排列整齊，核圓形，核仁清晰。凋亡細胞表現(xiàn)為細胞散在，細胞體積縮小，核固縮，染色質濃染或邊聚。硫酸鎂組、胞二磷膽堿組及聯(lián)合組與缺血組比較凋亡細胞減少，其中聯(lián)合組較其他組凋亡細胞明顯減少。

2 Bcl－2蛋白染色 Bcl－2蛋白染色陽性細胞表現(xiàn)為胞質染色棕黃色，顆粒狀分布，胞核不著色，細胞體積正常。正常海馬區(qū)未見染色陽性細胞。缺血再灌注24h，Bcl－2明顯表達，硫酸鎂組、胞二磷膽堿組及聯(lián)合組與缺血組相比較明顯增加（P＜0．05）。缺血再灌注3d時陽性細胞較多，其中聯(lián)合組與其他組相比陽性細胞數(shù)目有明顯差異（P＜0．05）。缺血再灌注7d后陽性細胞逐漸減少，但聯(lián)合組陽性細胞與其他組比較仍有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0．01）。見表1。

表1 缺血再灌注后1、3、7d各組Bcl－2陽性細胞數(shù)比較（，個/每視野）

表1 缺血再灌注后1、3、7d各組Bcl－2陽性細胞數(shù)比較（，個/每視野）

注：與缺血組相比較＊P＜0．05，△P＜0．01

組 別 1d 3d 7d缺血組 12．0±1．4 9．8±1．9 6．3±1．4胞二磷膽堿組 13．5±1．5＊ 12．0±2．4＊ 9．0±1．9＊硫酸鎂組 18．0±1．7＊ 14．9±1．3＊ 10．0±2．0＊聯(lián)合組 25．1±1．6＊△ 21．3±1．8＊△ 16．9±1．6＊△

3 神經(jīng)行為功能觀察 缺血組行走實驗明顯遲緩于其他組（P＜0．01），聯(lián)合組肢體恢復與單一用藥組比較有明顯差異（P＜0．01），硫酸鎂組與胞二磷膽堿組比較無明顯差異。見表2。

表2 缺血再灌注后1、3、7d各組行走功能比較（，s/個）

表2 缺血再灌注后1、3、7d各組行走功能比較（，s/個）

注：與缺血組比較＊P＜0．05，△P＜0．01

組 別 缺血前 再灌注后1d 再灌注后3d 再灌注后7d缺血組 3．67±0．79 20．00±2．10 23．90±1．58 28．20±0．75胞二磷膽堿組 3．60±1．02 7．20±1．72＊ 8．20±1．33＊ 10．20±2．14＊硫酸鎂組 3．67±1．01 6．80±1．33＊ 7．60±1．02＊ 9．20±1．33＊聯(lián)合組 3．60±1．08 5．40±1．02＊△ 6．40±1．02＊△ 8．40±1．50＊△

討 論

研究［4］證實，細胞凋亡是腦缺血過程中神經(jīng)元損失的一種形式。細胞凋亡是通過合成某些新的蛋白質而實現(xiàn)的，而Bcl－2家族蛋白的調控是其中之一重要機制。研究顯示，低水平的Bcl－2 mRNA廣泛分布于發(fā)育中和成熟的大鼠腦中，Bcl－2基礎表達減少則易導致某些細胞死亡。Bcl－2是重要的抑制神經(jīng)元的凋亡的蛋白，在缺血后注定要存活的神經(jīng)元中表達。也有研究表明，腦缺血再灌注后24h海馬區(qū)的Bcl－2蛋白表達才明顯上升，啟動相應的保護機制。本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組大鼠凋亡神經(jīng)元數(shù)目與其他組相比明顯減少，說明聯(lián)合應用硫酸鎂及胞二磷膽堿抑制缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)功能缺損，對缺血損傷有明顯的治療作用。

硫酸鎂的神經(jīng)保護作用的研究主要為局灶性腦缺血的預防及治療方面［5－6］。鎂離子能夠阻斷由鈣超載引起的細胞損傷途徑，從而保護細胞線粒體的結構和功能、降低血腦屏障通透性、減輕腦水腫、縮小梗死體積［7－8］。本研究表明給予不同周期硫酸鎂均可有效減輕腦神經(jīng)細胞病理損害、增加Bcl－2蛋白表達，并促進大鼠行為功能恢復。胞二磷膽堿參與體內磷脂酰膽堿的合成，有改善腦代謝作用，并可減輕腦水腫，刺激神經(jīng)生長，還可恢復腦缺血后損害的膜結構的完整性。研究［9］認為胞二磷膽堿的腦保護作用與抑制腦缺血誘導的谷氨酸濃度升高、阻止缺血所致ATP水平下降、穩(wěn)定細胞膜、抑制自由脂肪酸的釋放和減少自由基的產(chǎn)生有關。本研究表明其與缺血組比較有明顯統(tǒng)計學差異，與硫酸鎂組比較無明顯統(tǒng)計學差異。而聯(lián)合組與其他各組比較均有統(tǒng)計學差異，說明聯(lián)合治療可優(yōu)于各單一藥物治療，能更顯著改善腦神經(jīng)功能恢復。

腦缺血缺氧的聯(lián)合治療目的是獲得完全的功能恢復及組織學正常的大腦。臨床實踐發(fā)現(xiàn)，除了具有多種治療效應的鈣離子通道阻滯劑有輕度益處外，各種單一的藥物治療均不能對神經(jīng)功能預后產(chǎn)生良好的效應。因此，需要對進一步聯(lián)合治療進行積極評價。細胞膜穩(wěn)定劑胞二磷膽堿及NMDA拮抗劑鎂的聯(lián)合使用可作用于級聯(lián)反應的不同方面，并減少藥物劑量，降低不良反應發(fā)生率，對缺血腦組織將有明顯的保護作用。

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