恩度聯(lián)合放療對鼻咽癌裸鼠成瘤的抑制作用及機(jī)制*

徐曉婷 李金利 秦頌兵 周菊英

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國常見的惡性腫瘤之一，放療是目前根治鼻咽癌的公認(rèn)和有效的手段。20余年來，隨著鼻咽癌影像學(xué)、放療技術(shù)及設(shè)備研發(fā)的進(jìn)展，鼻咽癌早期的局部控制率可達(dá)70%~90%，但晚期（Ⅲ、Ⅳ期）僅為50%，5年總生存率（OS）僅40%~70%[1]。因此，如何提高鼻咽癌放射治療的敏感性始終是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。20世紀(jì)70年代，F(xiàn)olkman[2]首次提出通過抑制血管生長、切斷營養(yǎng)供給而達(dá)到抑制并消除腫瘤的設(shè)想。重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液（商品名：恩度）是在內(nèi)皮抑素的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，在母體的N端添加了9個(gè)氨基酸殘基序列，較內(nèi)皮抑素對蛋白酶、酸、熱的穩(wěn)定性更佳[3]。本研究旨在研究恩度聯(lián)合放療對鼻咽癌的抑制作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和裸鼠 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，BALB/c（nu/nu）裸鼠24只，雌性，4周齡，體質(zhì)量15~18 g，購于中國科學(xué)院上海動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2008-0005]，蘇州大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)條件下統(tǒng)一飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶（美國GIBCO公司），小牛血清（杭州四季青公司）；恩度注射液（南京先聲藥業(yè)有限公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；MMLV（Promega公司）；DEPC（BBI公司）；Ex TaqTMR-PCR Version 2.1（大連寶生物公司，DRR031）；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Survivin和6對隨機(jī)引物（上海生工生物公司）。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（上海HERAEUS BB5060型）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS CK-2型）；ABI 9600低溫高速離心機(jī)（德國Heraeus公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立鼻咽癌裸鼠成瘤模型 在CNE1細(xì)胞處于指數(shù)生長期，細(xì)胞總量充足，以0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×107個(gè)/mL，按0.2 mL/只推注入裸鼠右后肢腹股溝皮下。

1.2.2 成瘤后隨機(jī)分組并實(shí)施干預(yù) 接種瘤細(xì)胞后每天觀察裸鼠精神狀態(tài)、飲食、對外界的反應(yīng)及成瘤情況等，成瘤后每4 d測量腫瘤體積V=LD×SD2×0.5（LD：腫瘤最長徑，SD：腫瘤最短徑）。當(dāng)成瘤體積增至300~500 mm3時(shí)，隨機(jī)將裸鼠分為對照組、恩度組、放療組及恩度+放療聯(lián)合組（聯(lián)合組），每組6只。對照組：瘤周注射生理鹽水0.2 mL/次，1次/d，連續(xù)10 d；恩度組：每只裸鼠20 mg/（kg·d）瘤周注射恩度注射液，連續(xù)10 d；放療組：成瘤處以5 MeV局部單次20 Gy照射；聯(lián)合組：將恩度組和放療組的處理方法同時(shí)處理此組。

1.2.3 觀察腫瘤生長延遲情況 計(jì)算絕對延遲時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)化延遲時(shí)間[4]。絕對延遲時(shí)間是指每個(gè)實(shí)驗(yàn)組腫瘤增大至原來體積的2倍所需的時(shí)間減去對照組腫瘤增大至原來體積的2倍所需時(shí)間；而標(biāo)準(zhǔn)化延遲時(shí)間是指聯(lián)合組的絕對延遲時(shí)間減去對應(yīng)單純治療組的絕對延遲時(shí)間。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算聯(lián)合組內(nèi)的恩度對放射的增效因子（enhencement factor，EF），即聯(lián)合組的標(biāo)準(zhǔn)化生長延遲時(shí)間與放療組的絕對生長延遲時(shí)間的比值。28 d后采用頸椎脫位處死裸鼠，摘取瘤體并稱瘤重。電鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time-PCR）檢測VEGF和Sur?vivin的表達(dá) （1）VEGF和Survivin引物的設(shè)計(jì)。VEGF上游：5′-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3 ′，下游：5′-TCACCGC CTCGGCTTGTCACA-3′；Survivin上游：5′-GCCAGATTTGAA TCGCGGGA-3′，下游：5′-GCAGTGGATGAAGCCAGCCT-3′。（2）瘤組織RNA的提取及cDNA的合成。管1：隨機(jī)引物2 μL，RNA 4 μL，DEPC H2O 9 μL 70 ℃，5 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；管2：5×Buffer 8 μL，MMLV 1 μL，Rnasin 0.5 μL，dNTP 1.25 μL，加H2O 14.25 μL；將管2加入管1中，37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，4℃，12 000 r/min離心5 min。（3）Real time-PCR。5×buffer 5 μL，Mg2+0.25 μL，dNTP 0.75 μL，TaqMen 0.25 μL，Primer 1，0.5 μL，Primer 2，0.5 μL，Probe 0.3 μL，dH2O 15.45 μL，ample 2 μL 95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s 60 ℃ 60 s，50個(gè)循環(huán)4℃，12 000 r/min離心5 min。（4）Real time-PCR結(jié)果判定與分析。采用GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測基因mRNA的分子拷貝數(shù)。經(jīng)可行性試驗(yàn)驗(yàn)證目的基因與內(nèi)參的擴(kuò)增斜線差值小于0.1，應(yīng)用△△Ct法進(jìn)行定量分析。基因相對量=2-△Ct，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；實(shí)驗(yàn)組/對照組的相對量為2-△△Ct，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct-對照組△Ct，2-△△Ct值越大，目標(biāo)基因VEGF和Survivin mRNA的相對量越小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用x ±s表示；多組數(shù)據(jù)組間分析分別應(yīng)用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t法；相關(guān)性的判定用Pearson直線相關(guān)分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠接種后成瘤及生長狀況 裸鼠接種后12~15 d形成肉眼可見的皮下移植瘤，成瘤率100%；移植瘤早期多呈類球形，隨著腫瘤的生長，逐漸呈不規(guī)則形，表面出現(xiàn)結(jié)節(jié)或分葉狀突起；成瘤初期各組裸鼠飲食、活動(dòng)及對外界的反應(yīng)無明顯改變，隨著腫瘤的不斷增長，逐漸出現(xiàn)進(jìn)食活動(dòng)減少，體質(zhì)量減輕，對外界反應(yīng)遲鈍等異常。

2.2 成瘤生長情況 聯(lián)合組腫瘤體積增長受到明顯抑制，少數(shù)腫瘤停止生長，但均未出現(xiàn)腫瘤消退情況；對照組生長迅速；恩度組與放療組居中，見圖1。聯(lián)合組的腫瘤倍增時(shí)間長于其他3組，放療組的腫瘤倍增時(shí)間長于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），恩度組的腫瘤倍增時(shí)間與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；增效因子為1.23，見表1。

2.3 電鏡觀察腫瘤組織凋亡情況 對照組瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，絨毛豐富，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，核形態(tài)不規(guī)則，核漿比大，核內(nèi)異染色質(zhì)豐富；恩度組癌細(xì)胞數(shù)量較多，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)改變少見；放療組癌細(xì)胞數(shù)量減少，部分腫瘤細(xì)胞可見典型的凋亡改變；聯(lián)合組在電鏡視野里腫瘤細(xì)胞數(shù)稀少，腫瘤細(xì)胞損傷嚴(yán)重，核固縮，核均質(zhì)化溶解及核碎裂，細(xì)胞膜破裂形成細(xì)胞碎片，見圖2。

2.4 4組裸鼠成瘤組織中VEGF、Survivin表達(dá)水平比較 恩度組、放療組和聯(lián)合組的VEGF表達(dá)水平均低于對照組，聯(lián)合組低于放療組和恩度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），恩度組、放療組和聯(lián)合組的Survivin表達(dá)水平均小于對照組，聯(lián)合組小于放療組和恩度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表2。

2.5 VEGF與Survivin表達(dá)的相關(guān)性 成瘤組織中VEGF與Survivin的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.679，P<0.01）。

Figure 1 Growth curves of different treatment groups圖1 治療后各組成瘤生長曲線

Table 1 Inhibitory effects of endostar combined with radiotherapy on transplanted CNE1 nasopharyngeal carcinoma表1 放療聯(lián)合恩度對鼻咽癌CNE1成瘤的抑制效應(yīng)（±s）

Table 1 Inhibitory effects of endostar combined with radiotherapy on transplanted CNE1 nasopharyngeal carcinoma表1 放療聯(lián)合恩度對鼻咽癌CNE1成瘤的抑制效應(yīng)（±s）

**P＜0.001

對照組（1）恩度組（2）放療組（3）聯(lián)合組（4）F腫瘤倍增時(shí)間（d）9.0±1.0 12.0±2.3 26.0±4.7 35.0±5.4 49.846**絕對生長延遲（d）-3.0±1.3 17.0±3.7 26.0±4.4標(biāo)準(zhǔn)化生長延遲（d）---23±3.1增效因子---1.23組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）P 0.298<0.001<0.001<0.001 0.022統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組別

Figure 2 The cell apoptosis of tumor tissues detected by electron microscope（×4 800）圖2 各組瘤細(xì)胞凋亡的電鏡圖（×4 800）

Table 2 Expression levels of VEGF andSurvivin mRNA in tumor tissues表2 各組裸鼠鼻咽癌成瘤組織中VEGF和Survivin的表達(dá)水平 （n=6±s）

Table 2 Expression levels of VEGF andSurvivin mRNA in tumor tissues表2 各組裸鼠鼻咽癌成瘤組織中VEGF和Survivin的表達(dá)水平 （n=6±s）

**P＜0.01

VEGF（2-△△Ct）1.000±0.787 2.128±0.399 2.473±0.577 5.319±1.014 31.532**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）P 0.027<0.001<0.001<0.001<0.001 Survivin（2-△△Ct）1.000±0.864 2.990±1.072 3.624±1.182 7.868±2.995 13.619**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）P 0.019 0.031<0.001<0.001<0.001統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對照組（1）恩度組（2）放療組（3）聯(lián)合組（4）F組別

3 討論

局部晚期鼻咽癌患者鼻咽部腫瘤和頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)較大，腫瘤內(nèi)乏氧細(xì)胞多，放療效果差，且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高達(dá)20%~40%[1]。乏氧的環(huán)境促進(jìn)腫瘤血管的生成，腫瘤血管的生成又可以促進(jìn)腫瘤放療后的加速再增殖[5]。因此，如何提高腫瘤乏氧細(xì)胞的放射敏感性是本領(lǐng)域最為關(guān)注的問題之一。VEGF能特異性刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，促進(jìn)血管構(gòu)建，還具有促進(jìn)淋巴管形成及腫瘤細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移的作用?？寡苌莎煼芨慕[瘤紊亂的血管網(wǎng)，使之結(jié)構(gòu)、功能趨于正常化，從而改善血液循環(huán)，改善腫瘤的乏氧狀態(tài)，提高乏氧細(xì)胞的放射敏感性[6]。本實(shí)驗(yàn)選取拮抗VEGF受體的有效抗體恩度進(jìn)行鼻咽癌放射增敏實(shí)驗(yàn)，移植瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：聯(lián)合組的腫瘤生長速度明顯低于其他實(shí)驗(yàn)組，腫瘤生長延遲時(shí)間較放療組明顯延長（增效因子=1.23），說明恩度對裸鼠皮下成瘤的鼻咽癌有良好的放療增敏效應(yīng)。

Winkler等[7]發(fā)現(xiàn)，抗VEGF受體抗體能誘導(dǎo)腫瘤血管出現(xiàn)一個(gè)“血管正?；拇翱谄凇?，窗口期內(nèi)腫瘤血管與正常血管功能相似，腫瘤含氧量高，腫瘤細(xì)胞對放射線敏感，在窗口期內(nèi)放療能起到較好的協(xié)同抗腫瘤作用。達(dá)到腫瘤“血管正常化窗口期”正是目前臨床應(yīng)用恩度所關(guān)注的焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在連續(xù)使用恩度10 d后再進(jìn)行腫瘤的放療，取得了較好的放療增敏效果，提示連續(xù)給藥10 d后可能是腫瘤血管正?；摹按翱谄凇保@種藥物和放療序貫使用的方式為臨床使用恩度增敏放療提供一定的參考。

VEGF表達(dá)的高低體現(xiàn)頭頸部腫瘤放療的療效，VEGF表達(dá)越高，腫瘤放療預(yù)后效果越差[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：聯(lián)合組與恩度組、放療組相比，VEGF的表達(dá)都明顯降低，提示恩度和放療的聯(lián)合使用對抑制腫瘤中VEGF的表達(dá)有協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)各種腫瘤組織在放療后表現(xiàn)為VEGF表達(dá)水平上調(diào)，可能是機(jī)體在受到照射后產(chǎn)生的一種保護(hù)機(jī)制，誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生放療抗拒[9]。VEGF保護(hù)放療誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而此作用可以被抗VEGF抗體阻滯，因而恩度可能通過下調(diào)VEGF的表達(dá)提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，強(qiáng)化了放療的細(xì)胞毒作用。本實(shí)驗(yàn)中放療組VEGF的表達(dá)也低于對照組，這可能與單次大劑量放療后腫瘤負(fù)荷降低，VEGF的表達(dá)出現(xiàn)下降有關(guān)。

抗凋亡蛋白Survivin在所有人類腫瘤和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中大量表達(dá)，其可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，且還被證實(shí)參與血管的形成，可能的作用機(jī)制是介導(dǎo)VEGF促進(jìn)血管生成，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，降低放化療的敏感性[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合組與恩度組、放療組相比，Survivin的表達(dá)明顯降低，同時(shí)聯(lián)合組的VEGF和Survivin表達(dá)均低于對照組，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)?？梢姸鞫扰c放療聯(lián)合作用于裸鼠的鼻咽癌成瘤組織，通過下調(diào)Survivin的表達(dá)，從而抑制VEGF的抗凋亡活性，增加了放療后腫瘤細(xì)胞的凋亡，起到放射增敏的作用。

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