MMP-9、TIMP-1在心力衰竭幼鼠心肌中的表達(dá)

梅 峻，谷 麗，陸鳳鳳，楊 蓉

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院兒科，上海 200072)

目前，認(rèn)為小兒慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)發(fā)生是由心室重塑引起?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的主要蛋白水解系統(tǒng)，金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是(MMPs)的內(nèi)源性特異性抑制劑，本文擬通過建立后負(fù)荷過高的慢性心力衰竭幼鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用免疫組化法檢測心力衰竭幼鼠心肌MMP-9、TIMP-1的表達(dá)，以探討 MMP-9、TIMP-1在心室重塑中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型制作及實(shí)驗(yàn)分組

60只雄性5～6周齡Wistar幼鼠，對照組10只(僅開腹并分離腹主動脈，但不予以結(jié)扎)，余50只采用腎上腹主動脈縮窄法制作慢性心力衰竭模型，喂養(yǎng)5周后，死亡22只，余28只幼鼠中有18只出現(xiàn)明顯心力衰竭表現(xiàn)，隨機(jī)抽取這18只幼鼠中的10只行血流動力學(xué)測定，證明均達(dá)到心力衰竭(左室舒張末壓≥15 mmHg)［2］，作為心力衰竭組，檢測血流動力學(xué)參數(shù)，用Masson染色法觀察左室心肌膠原形態(tài)，圖像分析測量膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)，免疫組化法檢測心室肌中MMP-9、TIMP-1表達(dá)。

1.2 血流動力學(xué)檢測

觀察期滿后測血流動力學(xué)指標(biāo)。10%烏拉坦腹腔麻醉，導(dǎo)管內(nèi)充滿肝素，右頸總動脈逆行插管至左心室，另一端接多媒體生物信號記錄儀系統(tǒng)，記錄分析后得左室舒張末壓(LVEDP)。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 血流動力學(xué)指標(biāo) 9周后測左室舒張末壓(LVEDP)。

1.3.2 幼鼠心肌細(xì)胞和膠原的定性和定量分析取左室縱截面心肌組織，常規(guī)固定、包埋和制片，進(jìn)行MASSON染色:在MASSON染色下心肌細(xì)胞呈紅色，膠原呈藍(lán)色。采用 Biosens Digital Imaging System醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，測量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)及心肌血管周圍膠原面積和管腔面積之比(PVCA)。其中CVF=心肌膠原面積/所測視野面積，PVCA=小動脈管腔周圍膠原面積/管腔面積，每張心肌切片標(biāo)本均隨機(jī)取4個(gè)視野測量，取平均值。

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測 兔抗大鼠MMP-9多克隆抗體購自北京中杉金橋生物公司，TIMP-1抗體購自武漢博士德生物工程公司。sp免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。免疫組化方法按說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05或P＜0.01認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組幼鼠一般狀態(tài)變化

模型制作5周后對照組幼鼠一般狀態(tài)正常，模型組幼鼠出現(xiàn)明顯心力衰竭表現(xiàn)。

2.2 各組幼鼠的血流動力學(xué)及心肌纖維化指標(biāo)的變化(表1)

表1 各組幼鼠LVEDP、CVF、PVCA的變化Tab.1 Changes of LVEDP，CVF，PVCA in 2 groups of juvenile rats

由表中數(shù)據(jù)可知，心力衰竭組幼鼠與對照組幼鼠相比，LVEDP顯著升高，各指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明心力衰竭模型制作成功，心力衰竭組幼鼠心肌收縮和舒張能力下降。心力衰竭組幼鼠同對照組相比，心室肌纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大，間質(zhì)中可見基質(zhì)沉積，血管周圍可見反應(yīng)性纖維化，反映心室重塑的指標(biāo)CVF、PVCA差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 各組幼鼠心肌 MMP-9、TIMP-1表達(dá)的變化(表2)

表2 各組幼鼠心肌MMP-9、TIMP-1平均灰度值的比較Tab.2 Comparison of the average value of MMP-9 and TIMP-1 in rat myocardium

MMP-9在對照組幼鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)較弱，在心力衰竭組強(qiáng)陽性表達(dá)，兩組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TIMP-1在心力衰竭組幼鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)較對照組明顯減弱，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01～0.05)。MMP-9/TIMP-1比值在心力衰竭組幼鼠明顯高于對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討 論

MMP-9是由Sopata和Dancewica在1974年從人的中性粒細(xì)胞中首次提純，1989年的金屬蛋白酶學(xué)會上被正式命名。分子量92 KDa，是已發(fā)現(xiàn)的MMPs中分子量最大的酶。主要由成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞合成［3］。TIMP-1(28 KD)廣泛存在于組織和體液中，被多種細(xì)胞因子(IL-1，TGF-d等)誘導(dǎo)表達(dá)，與膠原酶和明膠酶有高親和性，是MMP-9的特異抑制因子，是體內(nèi)調(diào)節(jié)MMP-9活性的重要內(nèi)生性抑制系統(tǒng)［4］。

越來越多的實(shí)驗(yàn)及臨床研究證明MMP-9水平的增高在心室重塑中起著非常重要的作用［5］，研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9對基底膜的過度的降解會影響心肌細(xì)胞的空間排列和組合［6］。心房顫動時(shí)，MMP-9表達(dá)增加可導(dǎo)致心房肌細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解，使心房肌細(xì)胞對機(jī)械牽張抵抗力下降，并易于擴(kuò)張。Khan等在快速心室起搏誘導(dǎo)的犬的心力衰竭模型中發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭發(fā)展的不同階段左房、右房壓力及左房壁張力指數(shù)均顯著增高，心力衰竭末期心房肌細(xì)胞肥大，心房膠原合成和降解增加，膠原纖維排列紊亂。在心室擴(kuò)張伴心力衰竭鼠模型心臟中MMP-9活性顯著增強(qiáng)。心肌梗死后，移除MMP-9基因的小鼠，左心室的擴(kuò)張程度明顯減低。這是因?yàn)镸MP-9活性增高導(dǎo)致過度降解細(xì)胞外基質(zhì)，降解正常的膠原蛋白，結(jié)果被纖維性間質(zhì)所取代，造成心肌收縮的協(xié)調(diào)性減弱，最終導(dǎo)致心室壁變薄和心腔擴(kuò)張［7］。既往研究發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭時(shí)MMP-9表達(dá)水平增高與以下因素有關(guān):①TIMP的抑制作用。研究表明 MMP-9與TIMP-1關(guān)系密切，機(jī)理推測TIMP-1可能通過第17-19位的亮氨酸一擷氨酸一異亮氨酸與MMP-9的S1'-S2'-S3'區(qū)結(jié)合，從而抑制其活性［8］。②細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物(EMMPRIN)，把人心肌成纖維細(xì)胞暴露于重組的EMMPRIN時(shí)，可誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)［9］。③腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活。慢性心力衰竭時(shí)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活，使RAAS活性增高，通過收縮阻力血管維持血壓及刺激醛固酮分泌導(dǎo)致水鈉潴留，從而維持心輸出量和重要器官供血。如果心力衰竭病因不能及時(shí)清除，循環(huán)中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平的持續(xù)增高，通過一系列復(fù)雜的機(jī)制增加MMP-9的表達(dá)［10］。

研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1的正常表達(dá)是維持正常的心臟結(jié)構(gòu)所必需的，TIMP-1基因敲除的大鼠心肌梗死后左室顯著擴(kuò)張，心臟超聲顯示其左室舒張末容積增加18%，心臟重量增加38%。隨心力衰竭加重，心肌TIMP-1 mRNA表達(dá)下調(diào)。免疫組化發(fā)現(xiàn)，心力衰竭末期心肌標(biāo)本TIMP-1顯著下降。另有研究表明TIMP-1可能通過細(xì)胞表面的TIMP-1受體起作用，具有抗凋亡促生長的作用。由于TIMP-1的減少，抗凋亡促生長的作用減弱，造成心肌細(xì)胞凋亡增加，加重心室重構(gòu)過程。本試驗(yàn)研究也表明在幼鼠衰竭心臟中TIMP-1表達(dá)水平是降低的［11］。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了充血性心力衰竭幼鼠動物模型，發(fā)現(xiàn)與對照組幼鼠相比，心力衰竭組幼鼠心肌中MMP-9、MMP-9/TIMP-1的比值增高，提示MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平的變化與心室重塑的形成可能有關(guān)。本試驗(yàn)研究表明，MMP-9/TIMP-1相互作用的失衡參與了心力衰竭幼鼠心室重塑的發(fā)病過程。

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