天然水中氮素形態(tài)對菹草富集和降解DBP作用的影響

遲 杰，蔡曉丹，黃建軍

(天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072）

沉水植物廣泛分布在江河湖泊中，在水污染防治中起著重要的作用，是水體修復(fù)過程中的先鋒物種[1]．沉水植物的大部分生活周期中整個植株生長在水下，能夠通過莖葉從水中直接吸收營養(yǎng)物質(zhì)和污染物．研究發(fā)現(xiàn)，伊樂藻、狐尾藻和黑藻可以有效富集和降解有機(jī)污染物，如有機(jī)氯農(nóng)藥和有機(jī)磷農(nóng)藥[2]．菹草對鄰苯二甲酸酯(PAEs)和有機(jī)氯農(nóng)藥都有一定程度的富集[3]．

菹草(Potamageton crispus L.)是眼子菜科的多年生沉水草本植物，秋季發(fā)芽，越冬生長，是特殊的冬春季生活型植物，夏季多數(shù)植株衰敗死亡，生殖芽落入水底進(jìn)入夏季休眠期．有研究表明，菹草生長過程中對不同形態(tài)氮素的吸收具有選擇性[4-5]．氮素形態(tài)和濃度是重要的水質(zhì)指標(biāo)，對菹草的生長和生理活性產(chǎn)生影響，因此可能會對菹草去除污染物的能力產(chǎn)生影響．目前，相關(guān)研究國內(nèi)外未見報道．

PAEs是目前世界上生產(chǎn)量大、應(yīng)用面廣的人工合成有機(jī)化合物，特別是在塑料工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用．由于 PAEs 在塑料及其他制品中呈游離狀態(tài)，隨著時間的推移，極易轉(zhuǎn)移進(jìn)入環(huán)境，而廣泛存在于大氣、水體、土壤以及生物體中[6]．國內(nèi)外大量實驗顯示，PAEs具有致畸性、致突變性、致癌性及生殖毒性[7]，是美國環(huán)?？偩趾臀覈鴥?yōu)先檢測的污染物，鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)也是其中之一．

筆者利用組培菹草，選取了4種氮素形態(tài)特征不同的天然水樣，研究了天然水中氮素形態(tài)對菹草富集和降解 DBP的動力學(xué)過程的影響．同時還測定了菹草對水中不同形態(tài)氮素的吸收作用及生理指標(biāo)(葉綠素、可溶性蛋白和硝酸還原酶活性)．在此基礎(chǔ)上，分析了氮素形態(tài)對菹草富集和降解DBP能力的影響．

1 材料和方法

1.1 實驗材料

鄰苯二甲酸二丁酯(AR)，密度 1.045～1.047 g/mL，純度≥99.5%，天津市化學(xué)試劑一廠生產(chǎn)；其余試劑均為分析純．菹草的組織培養(yǎng)采用 Zhou等[8]的方法，采集生長旺盛期的菹草植株進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖．實驗用水分別取自海河干流市區(qū)段(三岔口(H-1)和大光明橋(H-2))和天津大學(xué)校內(nèi)的兩個小型封閉湖泊(青年湖(L-1)和敬業(yè)湖(L-2))，共4個采樣點．

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 DBP降解實驗

每個采樣點各取水 6份，每份 200,mL置于250,mL錐形瓶中，封口，0.15,MPa滅菌20,min．無菌條件下取(2±0.5),g菹草3份，分別放入3個錐形瓶中；另外 3個錐形瓶不加菹草，為空白實驗．錐形瓶中均準(zhǔn)確加入 DBP的乙醇儲備液，使實驗濃度約為0.4,mg/L．置于 25,℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)．培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度(3,000±100),lx，光照光暗周期12,h∶12,h，每天搖動3次．

1.2.2 氮、磷濃度及生理指標(biāo)實驗

每個采樣點各取水 12份，每份 200,mL置于250,mL錐形瓶中，0.15,MPa滅菌 20,min．無菌條件下取(2±0.5),g菹草分別放入錐形瓶中，置于 25,℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同第1.2.1節(jié).

1.3 實驗方法

1.3.1 酞酸酯的測定

無菌條件下，分別于第0、1、3、5、7和 10天準(zhǔn)確移取(取樣時先將液體搖勻)水樣 5,mL于 25,mL具塞試管中，加入 0.5,mL CH2,Cl2，振蕩萃取 10,min后，靜置 5,min分層，然后用膠頭滴管將下面的有機(jī)層吸到K-D管中．如此重復(fù)3次，合并有機(jī)相，在N2吹脫下濃縮至1,mL．GC-MS測定．

分別于第0和第10天稱取1,g植物樣品(濕重)，剪碎，放入組織研磨器，加入 5,mL CH2Cl2，研磨5,min，移出植物勻漿至離心管中(移取時先用少量CH2Cl2淋洗，再用適量水淋洗)．4,500,r/min離心5,min，先去掉上層水相，然后用膠頭滴管吸取CH2Cl2層到 K-D 濃縮器中，在 N2吹脫下濃縮至1,mL．GC-MS測定．

處理后的樣品用 Agilent6890N/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀測定(配石英毛細(xì)管柱 HP-5MS)．升溫程序為：初始溫度 100,℃，保持 1,min，以 20,℃/min升至280,℃，保持 3,min．載氣 He，流量為 1.0,mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣1,μL，進(jìn)樣口和檢測器溫度均為250,℃，接口溫度 280,℃，EI源 70,eV．

1.3.2 氮、磷濃度及生理指標(biāo)的測定

分別于第0、2、5和10天各取出3個錐形瓶(取樣時先將液體搖勻)，測定水樣中 TN、NO3－-N、NH4+-N及TP、溶解性總磷(DTP)、溶解性正磷酸鹽(D-PO42-)的濃度；同時取適量菹草，用蒸餾水沖洗并吸干表面水分，測定菹草中葉綠素、可溶性蛋白含量及硝酸還原酶的活性，結(jié)果取平均值．氮磷指標(biāo)的測定參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第 4版)．采用分光光度法測定菹草葉綠素含量，采用紫外吸收法測定可溶性蛋白含量，采用活體法測定硝酸還原酶的含量．

2 結(jié)果與討論

2.1 水中氮、磷的形態(tài)特征

4個采樣點的TN濃度均超出地表水質(zhì)Ⅴ類標(biāo)準(zhǔn)(表 1，第 0天數(shù)據(jù))．海河采樣點 H-1的水樣中 TN濃度比H-2高．這是因為H-1位于海河上游，地處永定河、大清河和子牙河的交匯處．來自上游農(nóng)田灌溉等污水匯聚于此使該點 TN含量較高．湖泊采樣點L-1的水樣中TN比L-2高，原因是L-2為噴泉觀賞湖，水質(zhì)較L-1清潔．

海河水中氮的形態(tài)特征明顯不同于湖泊水(表1，第0天數(shù)據(jù))．海河采樣點H-1和H-2的水樣中氮主要是以 NO3--N的形式存在，分別占 TN濃度的59.4%和 59.6%；海河水中 NO3--N/TN含量平均較湖水高45.8%．而湖泊采樣點L-1和L-2的水樣中氮主要是以 NH4+-N的形式存在，分別占 TN濃度的47.7%和 67.2%；湖泊水中 NH4+-N/TN含量平均較海河水高出 26.6%．王倩怡[9]于 2009年 3月～10月對海河 H-1和湖泊 L-2 2個采樣點的水質(zhì)進(jìn)行了大量的采樣調(diào)查，本研究中氮的形態(tài)特征與她的研究結(jié)果一致．文獻(xiàn)[10]結(jié)果也表明，受農(nóng)田徑流影響的河流湖泊水體受 NH4+-N污染的風(fēng)險較小，受 NO3--N的污染較重；居民區(qū)、養(yǎng)殖區(qū)的河流湖泊主要受生活污水的影響，水體NH4+-N負(fù)荷較高．

4個采樣點的 TP質(zhì)量含量為 0.11～0.17,mg/L，H-1屬于Ⅳ類水質(zhì)，其他 3個采樣點均超出Ⅴ類標(biāo)準(zhǔn)；DTP占TP的比例為25.3%～81.8%，D-PO42-含量均低于方法檢出限．

表1 水中不同形態(tài)氮素質(zhì)量濃度的變化Tab.1 Mass concentration changes of the different nitrogen forms in natural waters

2.2 天然水中菹草對DBP的富集和降解作用

4個采樣點水中的 DBP濃度隨時間變化見圖1．實驗初始的2,d內(nèi)，水中DBP的濃度下降均較快，尤其以 H-1最為顯著(54.4%)，而后下降減慢．實驗結(jié)束(第10,天)時，水中 DBP的消減率依次為 H-1(79.9%)＞H-2(71.8%)＞L-2(36.9%)＞L-1(21.2%)．海河采樣點的平均消減率(75.8%)明顯大于湖泊采樣點(29.0%)．以lnC對時間t做圖，兩者存在良好的線性關(guān)系(R2≥0.814,4)，說明菹草對 DBP的去除過程符合一級反應(yīng)動力學(xué)．扣除無菹草空白后，菹草對水中 DBP去除的一級動力學(xué)常數(shù)(k)依次為0.80×10-2,d-1、3.47×10-2,d-1、11.7×10-2,d-1和11.2×10-2,,d-1(見圖 2)．將 k值與水中不同形態(tài)氮、磷濃度對比發(fā)現(xiàn)，實驗初始水中 NO3--N濃度越高，k值越大(見圖 2)；k值與其他形態(tài)氮、磷濃度之間的相關(guān)性不明顯．

菹草對水中 DBP的去除作用包括2部分：降解和富集．DBP首先吸附在菹草表面，再進(jìn)入植物體，而后被降解．表面吸附是一個快過程，實驗初期菹草對 DBP以吸附和吸收作用為主，因此第 2天水中DBP含量下降較快．實驗結(jié)束時，4個采樣點(L-1、L-2、H-1和H-2)水樣中菹草體內(nèi)殘留的DBP含量分別為 0.794,mg/kg、0.584,mg/kg、0.452,mg/kg 和0.728,mg/kg. 扣除實驗初始時菹草體內(nèi) DBP的本底濃度后，這 4個水樣中菹草富集占 DBP總?cè)コ谋壤秊?1.22%～7.41%，說明實驗周期內(nèi)降解是菹草去除水中DBP的主要途徑．

圖1 菹草對水中DBP含量的影響Fig.1 Effect of P. crispus on DBP concentration in water

圖2 菹草對DBP的降解速率常數(shù)和富集系數(shù)Fig.2 Degradation rate constant and PCF of DBP by P. crispus

污染物在植物中的富集系數(shù)(PCF)為污染物在植物中濃度與在周圍水體中濃度的比值．菹草對DBP的 PCF值見圖 2．4個采樣點(L-1、L-2、H-1和H-2)水樣中菹草的PCF值依次為0.94,L/kg、2.07,L/kg、4.76,L/kg和7.43,L/kg．海河水樣中菹草的PCF值明顯大于湖泊，說明菹草在海河水中對 DBP的富集作用顯著，與海河水中較高的 DBP消減率相一致．據(jù)現(xiàn)場采樣調(diào)查顯示[3]，DBP在菹草中的 PCF值為 0.8～53.5(均值 18.3)，與菹草的生長狀況有關(guān)．本文的PCF值在文獻(xiàn)結(jié)果范圍內(nèi)．

2.3 菹草對水中不同形態(tài)氮素的吸收作用及其生理指標(biāo)的變化

4個采樣點的水樣中不同形態(tài)氮的含量隨時間的變化見表1．可見，菹草生長對水中氮有明顯的吸收作用．實驗結(jié)束時TN含量減少了34.9%～56.2%(平均44.8%)，下降明顯．其中，NO3--N含量的減少最為顯著，減少比例為 50.0%～90.3%(平均 70.0%)，減少程度從大到小依次為 H-2≈H-1＞L-2≈L-1．整個實驗過程中，海河水樣中 NH4+-N含量基本沒有變化．實驗結(jié)束時湖泊L-1和L-2采樣點的水樣中NH4+-N濃度分別降低 35.4%和 31.5%(平均 33.4%)，明顯低于NO3--N的下降比例．這說明菹草對 NO3--N的利用能力遠(yuǎn)大于 NH4+-N；湖泊水中由于 NO3--N含量較低，因此會部分利用NH4+-N．

菹草對氮素的選擇性吸收也表現(xiàn)出對菹草生理活性的影響．從菹草葉綠素、可溶性蛋白含量和硝酸還原酶活性隨時間的變化趨勢(見圖3～圖5)可以看出，這 3項生理指標(biāo)與氮素形態(tài)和含量密切相關(guān)．L-2中菹草葉綠素含量先上升后下降，而H-1和H-2中菹草葉綠素含量先下降后上升，實驗結(jié)束時高于 L-1和 L-2．研究表明，NH4＋-N 濃度在 1.56～6.35,mg/L時，3,d內(nèi)能夠刺激菹草葉綠素含量升高[11]．本研究中，第 2,d菹草的葉綠素含量 L-1＞H-2＞L-2≈H-1，同 4個采樣點 NH4＋-N的初始濃度和濃度變化一致(見表 1)，這說明菹草在生長初期對 NH4＋-N 的利用速度較快[12]．然而，隨著時間延長，H-1和 H-2中菹草葉綠素含量上升，并高于L-1和L-2，說明NO3--N更有利于提高菹草的生理活性．文獻(xiàn)[13]也報道，NH4＋對植物的毒性作用較強(qiáng)．海河與湖泊這兩類水中菹草可溶性蛋白的相對變化規(guī)律與葉綠素相似．這兩個指標(biāo)均表現(xiàn)出NH4＋-N有利于菹草初始階段的生長，而 NO3--N更有利于菹草的長期生長．不同水質(zhì)的水中菹草的硝酸還原酶活性均呈現(xiàn)先上升再下降，最后趨于穩(wěn)定的趨勢．H-1和 H-2中菹草硝酸還原酶活性顯著高于 L-1和L-2，這與海河水中較高的NO3--N含量有關(guān)，因為NO3--N還原的過程，需要硝酸鹽還原酶的催化．海河水中NH4＋-N基本沒有消耗，菹草對氮素的需要幾乎都來自于 NO3--N(87.6%)．而湖泊水中的菹草盡管也吸收利用了部分NH4＋-N (33.4%)，但由水中氮營養(yǎng)的消耗比例來看，對NO3--N利用率較高(52.3%)．這3項生理指標(biāo)的測定結(jié)果說明，較高含量的 NO3--N能夠提高菹草的生理活性，進(jìn)而增強(qiáng)菹草對DBP的去除能力．

實驗結(jié)束時 TP和 DTP的含量略低于初始含量，PO42-含量變化不大，說明菹草生長對磷的吸收作用不顯著，該結(jié)果與文獻(xiàn)[14]報道一致．

圖4 菹草可溶性蛋白含量的變化Fig.4 Content changes of soluble protein in P. crispus

圖5 菹草硝酸還原酶活性的變化Fig.5 Changes of nitrate reductase activity in P. crispus

3 結(jié) 論

(1) 海河水中氮素的形態(tài)特征明顯不同于湖泊水．海河采樣點的水樣中氮素主要是以NO3--N的形式存在，而湖泊采樣點的水樣中氮素主要是以 NH4＋-N的形式存在．海河及湖泊水中磷的形態(tài)特征差異相對較小，主要以顆粒態(tài)磷和溶解性有機(jī)磷的形式存在．

(2) 菹草對 DBP有較顯著的富集和降解作用，去除過程符合一級動力學(xué)方程，且主要受水中 NO3--N含量的影響．水樣中菹草富集占 DBP總?cè)コ谋壤秊?1.22%～7.41%，表明降解是菹草去除水中 DBP的主要途徑．

(3) 菹草生長對水中氮素有明顯的吸收作用，并且對NO3--N的吸收利用能力遠(yuǎn)大于 NH4＋-N，但是對水中磷的吸收作用不顯著．菹草的生理指標(biāo)顯示，可溶性蛋白的相對變化規(guī)律與葉綠素相似，均表現(xiàn)為NH4＋-N初始含量較高的湖泊水中這2個指標(biāo)較高，隨后逐漸低于海河；海河水中硝酸還原酶的活性顯著高于湖泊水．

上述結(jié)果說明，較高含量的NO3--N能夠提高菹草的生理活性，進(jìn)而增強(qiáng)菹草對DBP的去除能力．海河水中 NO3--N 含量較高，更有利于菹草生長，因此海河水中的菹草對DBP的富集和降解作用較大．

［1］ 種云霄，胡洪營，錢 易. 大型水生植物在水污染治理中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2003，4(2)：36-40.Chong Yunxiao，Hu Hongying，Qian Yi. Advances in utilization of macrophytes in water pollution control[J].Techniquesand Equipment for Environmental Pollution Control，2003，4(2)：36-40(in Chinese).

［2］ Gao J P，Garrison A W，Hoehamer C，et al. Uptake and phytotransformation of o，p′-2 DDT and p，p′-2 DDT by axenically cultivated aquatic plants[J]. Agricalture Food Chemistry，2000，48(12)：61212-6127.

［3］ Chi J. Phthalate acid esters in Potamogeton crispus L.from Haihe River，China[J]. Chemosphere，2009，5(43)：48-52.

［4］ Hucbr D B，Gurham P R. Biphask mineral absorption of the submerged aquatic macrophyte Potamogeton crispus.L. [J]. Aquatic Botany，1983，16(3)：260-281.

［5］ 金送迪，李永涵，倪彩虹，等. 菹草對水中氮、磷的吸收及若干影響因素[J]. 生態(tài)學(xué)報，1994，14(2)：168-173.Jin Songdi，Li Yonghan，Ni Caihong，et al. Absorption of nitrogen and phosphorus in Potamogeton crispus and factors[J]. Acta Ecologica Sinica，1994，14 (2)：168-173(in Chinese).

［6］ Stales C A，Peterson D R，Parkerton T F，et al. The environmental fate of phthalate esters：A literature review[J]. Chemosphere，1997，35(4)：667 - 749.

［7］ Park J D，Habeebu S S M，Klaassen C D. Testicular toxicity of di-(2-ethylhexyl)phthalate in young Sprague-Dawley rats[J]. Toxicology，2002，171(2/3)：105 -115.

［8］ Zhou C F，An S Q，Jiang J H，et al. An in vitro propagation protocol of two submerged macrophytes for lake revegetation in east China[J]. Aquatic Botany，2006，85(1)：44-52.

［9］ 王倩怡. 富營養(yǎng)化水體中有機(jī)氯農(nóng)藥的污染及其與浮游植物間的相應(yīng)關(guān)系[D]. 天津：天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，2009.Wang Qianyi. Corresponding Relationship Between Pollution of Organochlorine Pesticides and Phytoplankton in Eutrophic Water [D]. Tianjin：School of Environmental Science and Engineering，Tianjin University，2009(in Chinese).

［10］ 許 海，劉兆普，焦佳國，等. 太湖上游不同類型過境水氮素污染狀況[J].生態(tài)學(xué)雜志，2008，27(1)：43-49.Xu Hai，Liu Zhaopu，Jiao Jiaguo，et al. Nitrogen pollution status of various types of passing-by water bodies in upper reaches of Taihu Lake[J]. Chinese Journal of Ecology，2008，27 (1)：43-49(in Chinese).

［11］ Britto D T，Sidddiqi M Y，Glass A D M，et a1. Futile transmembrance NH4＋cycling：A cellular hypothesis to explain ammonium toxicity in plants[J]. PNAS，2001，98：4255-4258.

［12］ 李新鵬，童依平. 植物吸收運轉(zhuǎn)無機(jī)氮的生理及分子機(jī)制[J]. 植物學(xué)通報，2007，24(6)：714-725.Li Xinpeng，Tong Yiping. Physiology and molecular mechanisms of inorganic nitrogen absorption and translocation of plant[J]. Chinese Bulletin of Botany，2007，24(6)：714-725(in Chinese).

［13］ Cao T，Xie P，Li Z Q，et a1. Physiological stress of high NH4＋concentration in wate column on the submersed macrophyte Vallisneria Natans L.[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2009，82(3)：296-299.

［14］ 高華梅，谷孝鴻，曾慶飛，等. 不同基質(zhì)下菹草的生長及其對水體營養(yǎng)鹽的吸收[J]. 湖泊科學(xué)，2010，22(5)：655-659.Gao Huamei，Gu Xiaohong，Zeng Qingfei，et al.Growth of Potamogeton crispus L. and its influence on the water quality under different substrate types[J]. Lake Science，2010，22(5)：655-659(in Chinese).