新城疫病毒感染活化的人肝星狀細(xì)胞系LX-2

李亞琳

(渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西渭南 714000)

新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)是單股負(fù)鏈RNA病毒，具有天然的在腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的特點(diǎn)?，F(xiàn)在有一種觀點(diǎn)認(rèn)為，NDV也可以在活化的非正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞中高效復(fù)制。早在1976年就有報(bào)道，NDV能夠在活化的T細(xì)胞中復(fù)制，并導(dǎo)致活化T細(xì)胞的死亡;后來又有報(bào)道證明，NDV能夠在非正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞中高效復(fù)制［1］。

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其活化是肝纖維化發(fā)生的主要原因，而肝纖維化是肝癌前病變的重要病理階段。因此著眼于活化HSC的靶向治療是抑制肝纖維化，改善肝癌狀況的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)［2］。由于活化HSC也是一種非正常的、具有增殖能力的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)以該細(xì)胞為出發(fā)點(diǎn)，探討溶瘤NDV在活化HSC中的復(fù)制情況，為肝纖維化治療以及肝癌的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒

人肝星狀細(xì)胞系LX-2(美國(guó)Mount Sinai醫(yī)學(xué)院Scott L.Friedman教授饋贈(zèng));重組NDFLtag-EGFP和溶瘤株 NDV-Italien(德國(guó)癌癥研究中心 Volker Schirrmacher教授饋贈(zèng))。NDFLtag-EGFP是由NDV LaSota株經(jīng)過反向遺傳技術(shù)獲得，能夠表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorecence protein，EGFP)。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(Hycolon公司);新生牛血清(中國(guó)杭州四季青公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);ReverTra Ace-α-TM(Toyobo公司);Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司);α-SMA、COLLAGENⅠ、TGF-β1 以及GAPDH引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成);重組人 TGF-β1(PeproTech Asia公司);雞抗NDV-HN一抗和兔抗雞IgY-FITC二抗(USBiological公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的制備:LX-2和小鼠原代培養(yǎng)HSC于37℃、5%CO2及飽和濕度下分別用DMEM(含5%或10%NBCS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 病毒的制備:將10 000 HU的NDV-Italien和NDFLtag-EGFP，按104～106倍稀釋，接種9～10日齡(溫度37℃，濕度60% ～65%的孵箱孵育9～10日)的無特異病原體(specific pathogens free，SPF)雞胚(梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，北京)，每只雞胚注射100 μL病毒到尿囊腔。繼續(xù)在溫箱中孵育3～4 d，每天翻蛋2次。第4天，將所有的雞胚置于4℃冰箱過夜以便于雞胚中的血液凝固，利于病毒收獲。

從4℃凍存的雞胚中吸出尿囊液，經(jīng)低速離心，棄去沉渣，含NDV的上清液再經(jīng)超速蔗糖密度梯度離心純化病毒。沉淀物用PBS重懸，血凝法測(cè)定NDV的滴度，并調(diào)整為5 000 HU，分裝，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 NDV的感染:細(xì)胞按一定密度接種在培養(yǎng)板中，過夜，待細(xì)胞完全貼壁后，用不含血清的培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，然后加入一定稀釋濃度的NDV，置培養(yǎng)箱中1 h。棄掉病毒液，再用不含血清的培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4 MTT檢測(cè)TGF-β對(duì)LX-2細(xì)胞的促增殖效應(yīng):LX-2細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，換成含0.5%NBCS的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h。TGF-β1用含有2%NBCS的 DMEM 分別稀釋成 2、1.5、1、0.5 和0.25 μg/L。對(duì)照孔不含TGF-β1。饑餓24 h后，細(xì)胞換上以上不同稀釋濃度的TGF-β1，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加5 g/L的 MTT［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide］溶液10 μL，4 h后，棄掉培養(yǎng)上清，每孔加100 μL的 DMSO，溶解形成的甲臢結(jié)晶，于490 nm分光光度法檢測(cè)細(xì)胞的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為:細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度值－對(duì)照組細(xì)胞吸光度值)×100%/對(duì)照組細(xì)胞吸光度值。

1.3.5 半定量RT-PCR分析LX-2細(xì)胞的基因表達(dá):LX-2細(xì)胞接種于6孔板中，按上述方法用含0.5%NBCS的DMEM培養(yǎng)基饑餓后，再用2 μg/L TGF-β1 刺激。24 h后，每孔加1 mL Trizol，置冰上裂解細(xì)胞5～10 min，收集裂解液到1.5 mL Eppendorf管中。根據(jù)Protocol提取總RNA，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm和280 nm處的吸光度值，計(jì)算RNA的含量和純度。

采用兩步法 RT-PCR檢測(cè) α-SMA、COLLAGENⅠ和 TGF-β1的表達(dá)。首先每個(gè)樣品取2 μg RNA，Oligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，用 ReverTra Ace-α-TM試劑盒反轉(zhuǎn)錄形成第1股cDNA。運(yùn)行條件是:42℃延伸30 min，99℃終止5 min。然后用rTaq polymerase和特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣品取2 μL的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系25 μL，運(yùn)行條件是:94℃ 預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，不同退火溫度下引物結(jié)合30 s，72℃ 延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)后，再72℃ 延伸10 min。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參。

表1 RT-PCR引物Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.3.6 熒光顯微鏡技術(shù)觀察NDFLtag-EGFP在LX-2及原代培養(yǎng)的小鼠HSC細(xì)胞中的復(fù)制:HSC細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中會(huì)自發(fā)活化，因此實(shí)驗(yàn)用NDFLtag-EGFP(1∶100稀釋)感染不同傳代的LX-2細(xì)胞和原代分離以及傳代的小鼠HSC細(xì)胞，觀察NDV在細(xì)胞中的復(fù)制情況。兩種細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到6孔板(預(yù)鋪蓋玻片)。24 h貼壁后或用2 μg/L TGF-β1預(yù)刺激后，按照上述方法進(jìn)行NDFLtag-EGFP感染，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用熒光顯微鏡直接觀察NDV在細(xì)胞中的復(fù)制情況。1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)定量NDFLtag-EGFP和NDVItalien在 LX-2細(xì)胞中的復(fù)制:NDFLtag-EGFP(1∶100稀釋)感染不同傳代的LX-2細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)ACS)檢測(cè)熒光強(qiáng)度以定量NDV在細(xì)胞中的復(fù)制。對(duì)于NDV-Italien的感染，需要將 LX-2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到6孔板。24 h貼壁后，用含有0.5%NBCS的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h。然后用2 μg/L TGF-β1預(yù)刺激LX-2細(xì)胞使其活化，再用NDV-Italien(1∶500稀釋)感染細(xì)胞，24 h后消化細(xì)胞，并用雞抗NDV-HN一抗和FITC標(biāo)記的兔抗雞二抗檢測(cè)NDV-Italien在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)，并用流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)ACS)檢測(cè)NDV在細(xì)胞中的復(fù)制。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖影響

不同濃度的TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞24 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖。TGF-β1促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖，且具有劑量依賴性，當(dāng)其濃度為2 μg/L時(shí)，細(xì)胞增殖率為24.6%(圖 1A)。用2 μg/L TGF-β1 刺激 LX-2 細(xì)胞，RT-PCR 檢測(cè)顯示，細(xì)胞中 TGF-β1、α-SMA和COLLAGENⅠmRNA的表達(dá)均顯著上調(diào) (P＜0.05)(圖1 B)。RT-PCR電泳條帶的灰度掃描結(jié)果(表2)，數(shù)字為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(±s)。

表2 RT-PCR電泳條帶的灰度掃描結(jié)果Table 2 The result of gray scanning for RT-PCR electrophoretic band

2.2 NDV在LX-2細(xì)胞中的復(fù)制

用NDFLtag-EGFP感染不同傳代的LX-2細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在傳代次數(shù)多的細(xì)胞中病毒復(fù)制率高，而在傳代次數(shù)少的細(xì)胞中病毒復(fù)制率低(圖2A)。FACS分析顯示，NDV復(fù)制率從P1代的15.65%±0.92%增加到P16代的23.05% ±1.5%(圖2B)。進(jìn)一步用FACS檢測(cè)了NDV-Italien在活化 LX-2細(xì)胞中的復(fù)制。LX-2細(xì)胞經(jīng)2 μg/L TGF-β1刺激活化后，NDV在細(xì)胞中的復(fù)制率增加了1.8倍，NDV復(fù)制率從12.8% ±1.4% 增加到22.7% ±1.7%(圖2C)。

圖1 TGF-β1促進(jìn)LX-2的活化Fig 1 TGF-β1 stimulated LX-2 cells to be activated

2.3 NDV在原代分離的小鼠HSC中的復(fù)制

用NDV感染分離的原代培養(yǎng)的小鼠HSC。結(jié)果顯示，隨著原代分離細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和傳代次數(shù)的增加以及 TGF-β1的刺激，細(xì)胞趨于活化，NDFLtag-EGFP在細(xì)胞中復(fù)制的效率也逐漸增加(圖3)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用到了兩株NDV，NDV-Italien和 NDFLtag-EGFP。NDV-Italien為野生型強(qiáng)毒株;NDFLtag-EGFP來源于弱毒株NDV-LaSota，其F基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，并將EGFP基因插入在NP基因的上游，因此能夠直接通過熒光顯微鏡觀察病毒在細(xì)胞中的復(fù)制情況［3］。

肝組織中HSC細(xì)胞的活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵。肝癌和肝硬化患者的肝組織中，α-SMA陽(yáng)性的HSC大量浸潤(rùn)也充分說明活化HSC在肝癌和肝硬化發(fā)展中的重要作用［4－5］。因此，靶向HSC的抗纖維化治療是一個(gè)重要的阻止肝癌肝硬化發(fā)生的有效途徑［6－7］。

HSC的活化有許多誘發(fā)因素，但受損的肝細(xì)胞分泌許多細(xì)胞因子來刺激其活化卻是最主要的原因之一。這些細(xì)胞因子中，最主要的是 PDGF和TGF-β1。TGF-β1主要是在HSC由靜止?fàn)顟B(tài)到活化狀態(tài)的成肌纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型過程中起作用，誘導(dǎo)HSC活化并產(chǎn)生過量的ECM進(jìn)而形成肝纖維化［8］。因此本實(shí)驗(yàn)用TGF-β1刺激LX-2使其活化。

實(shí)驗(yàn)用不同的方法調(diào)查了NDV在LX-2細(xì)胞中的復(fù)制情況。因?yàn)長(zhǎng)X-2細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中可以隨著傳代培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而自發(fā)的活化［9－10］，因此用NDFLtag-EGFP感染不同傳代的LX-2細(xì)胞，然后用熒光顯微鏡直接觀察或者用FACS分析NDV在細(xì)胞中的復(fù)制。結(jié)果證明，在傳代次數(shù)多的LX-2細(xì)胞中NDV的復(fù)制率越高，反之亦然。TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞使其活化后，NDV-Italien在活化的LX-2細(xì)胞中的復(fù)制效率也大幅度提高。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)用NDFLtag-EGFP感染原代分離的小鼠HSC，也得出了一致的結(jié)果，即隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)以及TGF-β1的刺激，細(xì)胞越趨于活化，NDV的復(fù)制效率也越高。所有這些結(jié)果證實(shí)了我們的假設(shè)，活化的HSC細(xì)胞更有利于NDV的感染，說明HSC細(xì)胞的活化易化了NDV在其中的復(fù)制。

NDV在臨床治療中因極少產(chǎn)生負(fù)面不良效應(yīng)而成為腫瘤生物治療的一個(gè)安全平臺(tái)［11］。它能夠在腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇性復(fù)制的主要原因是能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激壓力從而引起P53非依賴的細(xì)胞凋亡［12］。曾經(jīng)有關(guān)于NDV能在活化的T細(xì)胞中復(fù)制并促進(jìn)活化的T細(xì)胞凋亡的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)雖然證明了活化的非正常轉(zhuǎn)化的LX-2細(xì)胞是NDV復(fù)制的一個(gè)靶標(biāo)，但未能解釋HSC的活化之所以能夠易化NDV復(fù)制的機(jī)制，這是以后研究中有待解決的問題。

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