木瓜蛋白酶酶解雞骨渣的工藝條件優(yōu)化

張建威，李苗云，趙改名，許 雄，田 瑋，柳艷霞，高曉平

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450002)

雞骨渣是雞骨通過(guò)骨肉分離機(jī)后排出的廢渣，價(jià)格低廉，但它含有大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的肉類加工副產(chǎn)品，潛在的應(yīng)用價(jià)值很大［1］．目前用于深加工的雞骨不足總量的2%，雞骨渣的綜合利用率更低，大量的雞骨渣資源得不到利用，不但浪費(fèi)大，還導(dǎo)致環(huán)境污染［2］．由于雞骨本身帶有的腥味及其粉碎后的顆粒感，是企業(yè)利用雞骨渣資源面臨的重要問(wèn)題之一．生物酶解技術(shù)能水解骨渣上的肉類蛋白，使骨肉分離，制備功能性肉類提取物，從而提高加工副產(chǎn)品的附加值，是深度開(kāi)發(fā)和綜合利用雞骨渣資源的可行途徑［3］．木瓜蛋白酶具有價(jià)格便宜，反應(yīng)溫度低，作用底物廣泛等特點(diǎn)［4，5］，研究和優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解雞骨渣的工藝條件對(duì)雞骨渣的綜合利用具有重要意義，也為企業(yè)尋找新的突破口提供技術(shù)支持．目前應(yīng)用酶解技術(shù)實(shí)現(xiàn)骨肉分離或利用部分軟骨的研究較多［6～12］，而對(duì)雞骨渣的酶解優(yōu)化研究很少．對(duì)木瓜蛋白酶在肉的嫩化、膠原蛋白的提取和制備等方面有較多研究［13～14］，但對(duì)雞骨渣的酶解研究較少．因此，本研究以雞骨渣為對(duì)象，研究木瓜蛋白酶的水解條件，并對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為企業(yè)提供一定的技術(shù)支持．

1 材料與方法

1．1 主要試驗(yàn)材料和儀器

1．1．1 試驗(yàn)材料 從某公司原料庫(kù)同批同質(zhì)隨機(jī)3～5件上取雞骨若干小塊，共約2 kg，經(jīng)充分混合均勻后，備用．木瓜蛋白酶(60萬(wàn)U·g－1)由比利時(shí)PSM有限公司提供．

1．1．2 主要試劑與儀器 試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?205型食品加工機(jī)(博朗電器，匈牙利)，YXQGOI型蒸汽消毒器(山東新華醫(yī)療器械廠)．

1．2 雞骨渣的酶解與處理

取混勻后新鮮雞骨樣品50 g，放入三角瓶中，加入一定量的水，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度和時(shí)間，在水浴恒溫振蕩器中進(jìn)行酶解．酶解完畢，于90℃15 min滅酶，之后將樣品水洗沖渣過(guò)濾，一并轉(zhuǎn)入250 mL的容量瓶中，定容，獲得酶解液和酶解的殘?jiān)畬⑹Ｓ嗟臍堅(jiān)?5℃，自然晾干2 h后稱重，記錄殘?jiān)馁|(zhì)量．

1．3 酶解參數(shù)的單因素試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)pH值和加水量對(duì)雞骨渣酶解效果的影響不大．因此，本試驗(yàn)分別以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶底物比為主要因素進(jìn)行全因子實(shí)驗(yàn)，確定木瓜蛋白酶各因素的取值范圍．由于底物的單一性，酶底物比以加酶量表示，即以投放的酶量占原料雞骨渣量的百分比．以水解度和殘?jiān)繛橹饕u(píng)價(jià)指標(biāo)．

1．4 酶解參數(shù)的優(yōu)化

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert軟件進(jìn)行3因素Box-Benhnken設(shè)計(jì)，產(chǎn)生17個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素、水平及編碼參照單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行．分別以總氮回收率Y1、水解度Y2、殘?jiān)縔3綜合確定最佳酶解反應(yīng)參數(shù)．

1．5 中試驗(yàn)證

對(duì)優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行40 kg中試驗(yàn)證，分別以水解度、殘?jiān)俊⒖偟厥章蕿樵u(píng)價(jià)指標(biāo)．

1．6 分析方法

1．6．1 殘?jiān)康臏y(cè)定 殘?jiān)恐该附夂笫Ｓ鄽堅(jiān)馁|(zhì)量占酶解雞骨渣樣品質(zhì)量的百分含量，該指標(biāo)在一定程度上反映了骨肉分離的效果．酶解后，將剩余殘?jiān)?5℃自然晾干2 h后稱重，即為殘?jiān)浚?/p>

1．6．2 水解度的測(cè)定 根據(jù)Alder-Nissen的計(jì)算方法測(cè)定水解度［15］(Degree of hydrolysis，DH)．

1．6．3 總氮回收率

溶液性總氮:取經(jīng)充分混勻的酶解液5 mL，于水浴風(fēng)干，采用ISO 937—1978(E)方法測(cè)定總氮含量;總氮:按ISO 937—1978(E)方法進(jìn)行，表示為總氮．

1．7 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15．0處理，響應(yīng)曲面采用Design-Expert 7．0進(jìn)行分析．

2 結(jié)果與分析

2．1 不同工藝酶解雞骨渣的效果

2．1．1 溫度對(duì)雞骨渣酶解效果的影響 選取加酶量為 0．1%，加水量為 1g·g－1樣品，pH 值為 7，時(shí)間為2 h，分別在50，55，60，65，70，75 ℃下水解，結(jié)果見(jiàn)圖1．

圖1 溫度對(duì)水解度和殘?jiān)康挠绊慒ig．1 Effect of temperature on hydrolysis degree and remains

由圖1可以看出，反應(yīng)溫度太低，酶活力不足，水解較慢，反應(yīng)不完全;當(dāng)溫度較高時(shí)，部分酶失活，水解不完全．反應(yīng)溫度在65℃時(shí)，蛋白酶水解度最高，殘?jiān)孔钌伲?/p>

2．1．2 加酶量對(duì)雞骨渣酶解效果的影響 選取加酶量分別為 0．03%，0．06%，0．09%，0．12%，015%，0．18%，溫度為 65 ℃，加水量為1 g·g－1，pH值為7，酶解時(shí)間為2 h(圖2)．從圖2可以看出，加酶量在0．03% ～0．12%，水解度上升趨勢(shì)明顯，脫肉效果明顯增強(qiáng)，殘?jiān)繙p少．但到 0．12%以上，無(wú)論是水解度，還是殘?jiān)孔兓厔?shì)平緩．從經(jīng)濟(jì)角度考慮，確定0．1%為最佳酶用量．

圖2 加酶量對(duì)水解度和殘?jiān)康挠绊慒ig．2 Effect of enzyme concentration on hydrolysis degree and remains

2．1．3 時(shí)間對(duì)雞骨渣酶解效果的影響 選取水解時(shí)間為 0．5，1，1．5，2，2．5，3 h，溫度為 65 ℃ ，加水量為 1 g·g－1，pH 值為 7，加酶量為 0．1%(圖 3)．從圖3可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，0～3 h內(nèi)的水解度上升趨勢(shì)明顯，而到2 h時(shí)，殘?jiān)孔兓厔?shì)平緩．考慮生產(chǎn)效率和脫肉效果，時(shí)間控制在2 h之內(nèi)最佳．

2．2 酶解工藝條件的優(yōu)化

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert軟件對(duì)溫度、加酶量和酶解時(shí)間進(jìn)行了3因素Box-Benhnken設(shè)計(jì)，產(chǎn)生17個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1，溫度、加酶量和時(shí)間分別以X1，X2，X3表示．響應(yīng)曲面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，總氮回收率、水解度和殘?jiān)糠謩e以Y1，Y2，Y3表示．

圖3 酶解時(shí)間對(duì)水解度和殘?jiān)康挠绊慒ig．3 Effect of time on hydrolysis degree and remains

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Code and level of factors chosen for the experiments

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design and results

2．2．1 酶解工藝對(duì)總氮回收率的影響 從表3可以看出，總氮回收率回歸模型有意義(P＜0．000 1)．溫度、酶解時(shí)間和加酶量對(duì)總氮回收率的影響均顯著(P ＜0．05)．信噪比為14．84，失擬項(xiàng)為0．625 3，模型的校正擬合系數(shù) R2為0．896 9，表明由誤差引起的失擬不顯著，模型擬合度較好．

采用逐步回歸法得出酶解條件對(duì)總氮回收率的優(yōu)化方程，方程如下:

溫度和加酶量對(duì)總氮回收率影響的響應(yīng)曲面如圖4．隨著加酶量的增加，總氮回收率呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，當(dāng)加酶量增大到0．12%時(shí)，對(duì)總氮回收率的貢獻(xiàn)漸漸減弱．而溫度對(duì)總氮回收率的的影響較為復(fù)雜，從等高線可以明顯看出，溫度在58℃至接近65℃之間時(shí)，總氮回收率隨溫度增加而增強(qiáng)，超過(guò)65℃總氮回收率開(kāi)始下降，并且溫度越高水解度下降越快，這種變化受時(shí)間變化的影響很小．

圖4 溫度和加酶量對(duì)總氮回收率的影響Fig．4 Effects of temperature and enzyme concentration on the TN recovery

表3 總氮回收率回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA analysis of regression model of TN recovery

2．2．2 酶解工藝對(duì)水解度的影響 由表4可以看出，水解度回歸模型有意義(P＜0．0001)，溫度、酶解時(shí)間和加酶量對(duì)水解度的影響均顯著．信噪比為13．331，失擬項(xiàng) P=0．4850 ＞0．05，模型的校正擬合系數(shù)R2為0．8872，表明由誤差引起的失擬不顯著，該模型擬合度比較好．

采用逐步回歸法得出時(shí)間、溫度和加酶量對(duì)水解度的優(yōu)化方程如下:

表4 水解度回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA analysis of regression model of DH

溫度和加酶量對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面如圖5．加酶量在0．6% ～0．8%時(shí)，水解度隨著時(shí)間的增加而增加，而當(dāng)加酶量大于0．1%時(shí)，水解度變化趨于平穩(wěn)．溫度對(duì)水解度的影響與對(duì)總氮回收率的影響類似，當(dāng)溫度由低升高至55℃左右時(shí)，水解度逐漸增大，而溫度繼續(xù)增大時(shí)，水解度急劇的下降．

2．2．3 酶解工藝對(duì)殘?jiān)康挠绊?由表5可以看出，殘?jiān)康幕貧w模型顯著(P＞0．01)．溫度、酶解時(shí)間和加酶量對(duì)殘?jiān)康挠绊懢@著．信噪比為9．404，失擬項(xiàng) P ＞0．05，表明由誤差引起的失擬不顯著，該模型擬合度較好．

采用逐步回歸法得出時(shí)間、溫度和加酶量對(duì)殘?jiān)康膬?yōu)化方程如下:

圖5 溫度和加酶量對(duì)水解度的影響Fig．5 Effects of temperature and enzyme concentration on the degree of hydrolysis

表5 殘?jiān)炕貧w模型方差分析結(jié)果Table 5 ANOVA analysis of regression model of content of remains

溫度和時(shí)間對(duì)殘?jiān)坑绊懙捻憫?yīng)曲面如圖6．由圖6可以看出，溫度和時(shí)間對(duì)殘?jiān)坑泻軓?qiáng)的交互作用，當(dāng)水解時(shí)間較短在1～1．5 h時(shí)，溫度對(duì)殘?jiān)康挠绊懗尸F(xiàn)反向的拋物線型，在58～63℃，隨著溫度的增加，水解效果越強(qiáng)，殘?jiān)拷档?，而?dāng)溫度繼續(xù)上升至68℃時(shí)，殘?jiān)恳搽S之上升。從等高線可以看出，當(dāng)水解時(shí)間較長(zhǎng)，大于1．75 h，隨著溫度的上升，殘?jiān)恳恢背尸F(xiàn)下降的趨勢(shì)．

圖6 溫度和時(shí)間對(duì)殘?jiān)康挠绊慒ig．6 Effects of temperature and time on the content of remains

2．3 優(yōu)化的工藝參數(shù)驗(yàn)證

分別對(duì)總氮回收率最大、殘?jiān)孔钌?、水解度最高?者綜合考慮，對(duì)優(yōu)化的酶解工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表6所示．

殘?jiān)?、水解度和總氮回收率真?shí)值與預(yù)測(cè)值之間分別具有 88．2%，95．0%，86．5%的相關(guān)性，相關(guān)性較好，可以利用上述優(yōu)化方程方程對(duì)實(shí)際酶解過(guò)程進(jìn)行預(yù)測(cè)和控制．第1和3組進(jìn)行40 kg的中試時(shí)，產(chǎn)品骨肉分離干凈，殘?jiān)枯^低，分別為24．52%和24．50%，與小試結(jié)果基本一致．考慮企業(yè)的實(shí)際操作和條件，確定木瓜蛋白酶酶解優(yōu)化的參數(shù)為:溫度為65℃，加酶量在0．1%，反應(yīng)時(shí)間1．8 h，自然pH值和1∶1的料液比．該酶解條件中溫度、加酶量和反應(yīng)時(shí)間是影響酶解效果的重要因素，這與前人的研究結(jié)果相似［5，6］．利用該條件中試生產(chǎn)時(shí)能很好的水解雞骨渣，殘?jiān)枯^低，且總氮回收率在70%以上，目前該條件大部分企業(yè)基本上都能達(dá)到．因此，利用木瓜蛋白酶水解雞骨渣，為其深度開(kāi)發(fā)和綜合利用提供有效途徑和技術(shù)支撐，從而提高雞骨渣的附加值．

表6 響應(yīng)優(yōu)化值與真實(shí)值之間的關(guān)系Table 6 The relation between predicted response values and practiced values

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶酶解雞骨渣最適工藝條件:溫度為65℃，加酶量在0．1%，反應(yīng)時(shí)間 1．8 h，自然 pH和1:1的料液比，有最低的殘?jiān)?4．6%、水解度在14．68%，總氮回收率為71．68%，可用于其深度開(kāi)發(fā)和綜合利用．

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