酶聯(lián)免疫法鑒別乳制品摻假的研究進(jìn)展

文 / 任倩然 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部—北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目前市場(chǎng)上一些高檔乳制品產(chǎn)量較少，供應(yīng)量變化大，在利益的驅(qū)使下導(dǎo)致乳制品中摻假的違法事件時(shí)有發(fā)生。為應(yīng)對(duì)這一問題，開發(fā)快速可靠的乳制品摻假的鑒別方法就顯得十分重要。目前，針對(duì)乳制品摻假的鑒別方法主要分為免疫學(xué)法和非免疫學(xué)法[1]。非免疫學(xué)法包括高效液相色譜[2]、毛細(xì)管電泳[3]和等電聚焦電泳等[4]。盡管這些方法都各有優(yōu)點(diǎn)，但存在工作量大，成本高等問題。相比而言，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的方法就顯示出了更多的優(yōu)勢(shì)。在過去的幾年里，免疫分析法已成功地應(yīng)用到了乳制品的定量檢測(cè)和摻假鑒別中，酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）因其快速便捷，成本較低的優(yōu)點(diǎn)已成為應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一。

1 酶聯(lián)免疫法

1.1 反應(yīng)原理

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的基本原理是：在固相載體（如聚苯乙烯反應(yīng)板）上包被抗原或抗體后，通過抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原）結(jié)合到載體上。經(jīng)洗滌使結(jié)合的酶標(biāo)抗體和游離的酶標(biāo)抗體分離，洗去游離的酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原），加入底物顯色。底物顯色的程度與在實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)物濃度以及被測(cè)抗原或抗體的濃度成正比[5]。根據(jù)抗原、抗體的親和力和檢測(cè)條件，最低可以檢測(cè)到10 pg/mL的抗原或抗體。

1.2 分類

酶聯(lián)免疫法是以固相吸附技術(shù)為基礎(chǔ)的，根據(jù)Crowther的分類，可以分為以下4 種：①直接法：抗體或抗原包被于固相載體，直接與酶標(biāo)記的特異性抗體或抗原結(jié)合。②間接法：抗體和包被在固相載體上的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)。通過添加酶標(biāo)記二抗來(lái)檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原或抗體的量。③雙抗體夾心法：其中的直接法，是將特異性抗體（捕獲抗體）包被于固相載體后與抗原進(jìn)行結(jié)合，然后加入針對(duì)抗原的酶標(biāo)記特異性抗體（檢測(cè)抗體），加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。其中，捕獲抗體和檢測(cè)抗體可以是來(lái)源相同的血清也可以是來(lái)源不同的血清。這種方法要求欲測(cè)的抗原必須有2 個(gè)可以與抗體結(jié)合的位點(diǎn)。而在間接法中，檢測(cè)抗體和捕獲抗體是來(lái)自于不同的物種的，而酶標(biāo)抗體是和特異性檢測(cè)抗體而不是捕獲抗體綁定在一起的。④競(jìng)爭(zhēng)法：也可分為直接和間接競(jìng)爭(zhēng)法，2 個(gè)反應(yīng)物（抗體或抗原）和包被的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)，2 個(gè)反應(yīng)物（抗體或抗原）作為競(jìng)爭(zhēng)者同時(shí)參與到該反應(yīng)中[6]。

1.3 抗體

抗體是進(jìn)行酶聯(lián)免疫法的基礎(chǔ)，主要分為多克隆抗體和單克隆抗體。第一代抗體是多克隆抗體，即利用抗原免疫動(dòng)物后獲得的抗體；第二代抗體為單克隆抗體，即通過雜交瘤技術(shù)制備出針對(duì)抗原中某一抗原決定簇的抗體。

1.3.1 多克隆抗體的概念及制備方法

多克隆抗體是指用一種包含多種抗原決定簇的抗原來(lái)免疫動(dòng)物，即可刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。制備多克隆抗體首先要進(jìn)行免疫原的制備，包括天然抗原和人工合成抗原，然后用得到的抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。為了獲取高質(zhì)量的抗體，除了需制備高純度的抗原外，還需選擇適宜的動(dòng)物和設(shè)計(jì)有效可行的免疫方案，免疫后要將免疫血清通過親和層析、離子交換層析等方法進(jìn)行純化，用得到的較純的血清進(jìn)行效價(jià)、特異性、純度及親和力的鑒定。

1.3.2 單克隆抗體的概念及制備方法

單克隆抗體是指由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體，均一度高，特異性強(qiáng)，效價(jià)高，少或無(wú)交叉反應(yīng)性。單克隆的制備方法首先也要進(jìn)行免疫，免疫后進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定，之后選擇出效價(jià)合適的小鼠獲得其B淋巴細(xì)胞。而要得到單克隆抗體就需要得到能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞。但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長(zhǎng)，而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)可將骨髓瘤細(xì)胞與上面得到的淋巴細(xì)胞二者合二為一，即可得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。之后將得到的雜交瘤進(jìn)行選擇，然后運(yùn)用ELISA方法對(duì)抗體進(jìn)行初篩。將篩得的專一性雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法克隆化，之后向小鼠體內(nèi)接種該雜交瘤細(xì)胞制備腹水或血清，大量制備單抗，最后將抗體進(jìn)行純化鑒定并保存。

2 多克隆抗體酶聯(lián)免疫法在乳制品摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 抗乳清蛋白多克隆抗體的應(yīng)用

Garc í a等學(xué)者報(bào)道了使用針對(duì)乳清蛋白的多克隆抗體，采用間接ELISA法，定量檢測(cè)綿羊奶中摻假的牛奶。通過免疫兔子制備抗牛奶乳清蛋白的生物素標(biāo)記多克隆抗體，并利用綿羊和山羊乳白蛋白消除其與綿羊奶和山羊奶的交叉反應(yīng)。該方法可以檢測(cè)到1%～50%的牛奶添加到綿羊奶中。但是，這一方法對(duì)于商業(yè)上經(jīng)高溫滅菌的牛奶檢測(cè)限較低[7]。此外，他們還將制備出的抗體與凍干的牛乳清蛋白和綿羊乳清蛋白進(jìn)行混合反應(yīng)，選出具有特異性的兔抗山羊乳清蛋白的多克隆抗體，以間接ELISA方法檢測(cè)，可檢測(cè)到1%～100%的山羊奶摻入母羊奶中[8]。Sauer等人利用雙抗夾心法，用羊抗牛IgG的特異性抗體檢測(cè)在綿羊奶或山羊奶中摻入的牛奶，得到的抗體與綿羊、山羊的IgG和用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體無(wú)交叉反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)限為0.001%[9]。Garc í a等人利用雙抗夾心ELISA法，用兔抗山羊乳清蛋白多克隆抗體定量檢測(cè)，可以檢測(cè)到在綿羊奶中摻加的0.5%～100.0%山羊奶。但是對(duì)于滅菌后的山羊奶檢測(cè)結(jié)果較低[10]。綜上所述，乳清蛋白的免疫原性較好，但其對(duì)加熱很敏感，當(dāng)熱處理過的牛奶被用來(lái)檢測(cè)時(shí)可能會(huì)引起假陰性反應(yīng)。

2.2 抗酪蛋白多克隆抗體的應(yīng)用

乳制品的高溫處理有可能改變其中蛋白質(zhì)的抗原性，而相對(duì)于乳清蛋白，酪蛋白在免疫反應(yīng)中不會(huì)受到加熱處理的影響，因此，其更適合在免疫學(xué)方法中作為抗原來(lái)檢測(cè)不同種類的加熱乳制品。許多學(xué)者研究開發(fā)出了以針對(duì)酪蛋白的多克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)的方法。Rodr í guez等人使用間接ELISA方法可以檢測(cè)到綿羊奶中摻入1%～50%的牛奶，在生物素化后，兔抗牛酪蛋白的多克隆抗體與凍干的山羊和綿羊酪蛋白進(jìn)行混合，可提高其針對(duì)牛奶的特異性[11]。

除利用免疫奶中全酪蛋白產(chǎn)生的多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)外，又發(fā)展了利用酪蛋白單體對(duì)應(yīng)的多抗進(jìn)行乳制品摻假的鑒別，在一定程度上提高了檢測(cè)限。如兔抗牛γ3酪蛋白和雞抗牛γ3酪蛋白的多克隆抗體就被Richter等人在間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法中使用。實(shí)驗(yàn)通過固相吸附含有纖維蛋白溶解酶處理的綿羊酪蛋白來(lái)降低天然抗血清的交叉反應(yīng)，該方法的檢測(cè)限為0.1%，并且可特定的在以綿羊和山羊奶為原料的干酪中鑒別牛奶，高溫處理對(duì)結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生影響[12]。

2.3 抗乳蛋白多肽段多克隆抗體的應(yīng)用

對(duì)于針對(duì)合成多肽的多克隆抗體，相當(dāng)于定義一段可作為免疫抗原的酪蛋白或乳清蛋白的特異性區(qū)域（即肽段），合成后，以其作為人工抗原進(jìn)行免疫，產(chǎn)生的抗體被用來(lái)檢測(cè)在綿羊和山羊奶干酪中的牛奶。Bitri等人就采用了一種競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，用來(lái)檢測(cè)牛酪蛋白巨肽（CMP），從而來(lái)鑒別綿羊或山羊奶和干酪中是否混入了生的或者經(jīng)過加熱處理的牛奶。他們用化學(xué)合成的牛κ酪蛋白139～152肽段做抗原免疫產(chǎn)生兔抗多克隆抗體，純化后的抗原（牛CMP）通過酶標(biāo)板被固相吸附，然后和一定量的抗體進(jìn)行特異性反應(yīng)，可以檢測(cè)摻入0.25%～64.00%的牛奶[13]。Rolland等人化學(xué)合成了牛αs1酪蛋白的140～149肽段，該肽段比綿羊αs1酪蛋白缺失部分多了2 個(gè)氨基酸，并以此肽段免疫產(chǎn)生的特異性多克隆抗體用間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)[13]。通過這種方法可以檢測(cè)到在綿羊奶中0.125～64.00%的牛奶和在干酪中的0.5～25.0%的牛奶，并且加熱處理和干酪的成熟過程不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生顯著的影響[14]。

3 單克隆抗體酶聯(lián)免疫法在乳制品摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

多克隆抗血清是由大量單克隆抗體組成的，這些單克隆抗體有不同的特異性抗原決定簇，因而要得到特異性高的抗體就需要大規(guī)模地親和吸附和使用其它異種蛋白來(lái)進(jìn)行篩選[15]。

3.1 抗乳清蛋白單克隆抗體的應(yīng)用

Levieux等人采用針對(duì)牛β乳球蛋白的單克隆抗體，利用雙抗夾心ELISA法對(duì)山羊和綿羊奶中的牛奶進(jìn)行了檢測(cè)，此方法有很高的特異性和靈敏度并且重復(fù)性較好，可以檢測(cè)到1 份牛奶摻入到100 000 份綿羊奶及山羊奶中[16]。Negroni等人采用一種針對(duì)牛β乳球蛋白的單克隆抗體（MAb BLG-88N）作為捕獲抗體在改良雙抗夾心法中使用，可以檢測(cè)到0.03%的牛奶摻入到山羊奶中[17]。

3.2 抗酪蛋白單克隆抗體的應(yīng)用

Anguita等人研究發(fā)現(xiàn)，β酪蛋白在牛所有的酪蛋白中都顯示出較高的抗原性[18]。因此，他們以牛β酪蛋白做抗原得到單克隆抗體（MAB AH4），使用間接ELISA法分別檢測(cè)未經(jīng)處理的、經(jīng)過巴氏殺菌和超高溫滅菌的牛奶在山羊奶或母羊奶中的摻入情況，檢測(cè)限可以達(dá)到0.5～10.0%[19]。山羊αs2酪蛋白被認(rèn)為是山羊酪蛋白中免疫反應(yīng)最強(qiáng)的，因此Haza等人針對(duì)山羊αs2酪蛋白制備單克隆抗體[20]，實(shí)驗(yàn)所得的單抗與綿羊和牛的全酪蛋白均沒有明顯的交叉反應(yīng)，其中的MAb B2B顯示出很強(qiáng)的專一性，并且其反應(yīng)結(jié)果不會(huì)受到加熱處理的影響。應(yīng)用該單抗進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，可檢測(cè)到0.5～15.0%的山羊奶摻入母羊奶中[21]。之后，Haza等人又分別采用間接ELISA法和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法使用同一抗體定量檢測(cè)了山羊奶干酪摻入到母羊奶干酪中。結(jié)果表明，2 種方法可分別檢測(cè)1%～25%和0.5%～25.0%的山羊干酪摻入到母羊干酪中，并且發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果不會(huì)受到奶的加熱處理或干酪成熟的影響[22～23]。

4 小結(jié)

綜上所述，ELISA方法針對(duì)無(wú)論是微量的摻入還是經(jīng)過高溫處理的乳制品都可以進(jìn)行準(zhǔn)確地?fù)郊勹b別。在制備單抗的過程中，來(lái)自不同物種的蛋白質(zhì)之間的交叉反應(yīng)可以采用雜交瘤技術(shù)被消除，并且能連續(xù)不斷地產(chǎn)生具有專一性的抗體。這些抗體特異性地識(shí)別牛奶中的某種蛋白質(zhì)或者是某個(gè)特異性肽段，對(duì)進(jìn)行不同種類乳制品的檢測(cè)具有重要意義，應(yīng)用酪蛋白做抗原也可以克服在干酪成熟中干酪蛋白質(zhì)水解對(duì)其抗原特性的影響?？傊?，針對(duì)乳制品中的摻假鑒別，ELISA法已經(jīng)發(fā)展成為一種非常靈敏、可靠的分析方法。今后的發(fā)展趨勢(shì)是進(jìn)一步提高其特異性和靈敏度，通過與基因方法相結(jié)合的方式更加有效地鑒別乳制品中的摻假。

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