水楊酸鈉對(duì)高游離脂肪酸大鼠胰腺組織氧化應(yīng)激水平的影響＊

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科（沈陽110004） 何 冰 馬曉丹 張 微 韓 萍

血漿游離脂肪酸（FFA）升高是2型糖尿病和肥胖癥的臨床特征，增多的FFA超過脂肪組織貯備能力及周圍組織氧化能力，以甘油三酯的形式在非脂肪組織沉積造成該組織的損傷，如在胰島中過多沉積可以使胰島β細(xì)胞凋亡加速并使其功能減退［1］。最近有報(bào)道，水楊酸鹽可能改善高FFA引起的胰島β細(xì)胞凋亡，機(jī)制不清［2］。胰腺組織抗氧化能力差，F(xiàn)FA增多可使胰腺氧化應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡［3］。本研究擬觀察水楊酸鈉對(duì)脂肪乳誘導(dǎo)的高游離脂肪酸大鼠胰腺組織氧化應(yīng)激水平的影響。

材料與方法

1 動(dòng)物模型 雄性Wistar大鼠48只，體重230～260g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供，合格證號(hào)SYXK2003－0019，常規(guī)飼料自由飲水。10%水合氯醛腹腔麻醉，將聚乙烯導(dǎo)管2根，每根一端接有一段3cm長(zhǎng)的硅膠管分別植入右頸內(nèi)靜脈用于輸液和左頸動(dòng)脈用于采血［4］，大鼠術(shù)后恢復(fù)3d。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 大鼠隨機(jī)分為三組，每組7只：生理鹽水組（SAL組）靜脈輸注生理鹽水，脂肪乳組（IH組）輸注20%脂肪乳＋20U／ml肝素，水楊酸鈉＋脂肪乳組（SI組）輸注脂肪乳同時(shí)輸注水楊酸鈉，各組輸液時(shí)間為48h，速度5.5μl／min，水楊酸鈉以0.117mg／（kg·min）輸注。所有實(shí)驗(yàn)組均在試驗(yàn)的最后30min，每10min采動(dòng)脈血一次，備測(cè)血糖、胰島素、FFA和C肽。輸液48h后，剖腹取胰腺，液氮冷凍。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖（BIOSEN5030，德國(guó)），放射免疫法測(cè)定胰島素和C肽（解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所），比色法測(cè)定血漿FFA、胰腺組織丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）活性（南京建成生物公司）。

3.2 RT－PCR半定量測(cè)定胰島素基因合成調(diào)控因子－1mRNA的表達(dá)：提取RNA逆轉(zhuǎn)錄方法獲取cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。胰島素基因合成調(diào)控因子－1（PDX－1）上游引物5＇－ACATCTCCCCATACGAAGTGCC－3＇，下游 5＇－AAGTGAGCATCACTGCCAGCTCC－3＇，產(chǎn)物長(zhǎng)度364bp。以 GAPDH 為內(nèi)參，5＇－GTTCAACGGCACAGTCAAGG－3＇，下 游 5＇－CACCAGTGGATGCAGGGAT－3＇，產(chǎn)物長(zhǎng)度473bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)Bio－VT凝膠成像系統(tǒng)成像，ID Image Analysis Software半定量分析，以GAPDH為對(duì)照，PDX－1與其相比得到相對(duì)表達(dá)量，取均值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用單因素方差分析比較三組資料間差別，變量相關(guān)關(guān)系用直線相關(guān)和多元線性回歸分析，應(yīng)用SPSS.11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

結(jié) 果

1 三組大鼠血漿FFA、葡萄糖、胰島素及C－肽比較 與SAL組比較，IH組FFA增加2.4倍，血糖升高0.3倍，胰島素和C－肽分別增加了1.6倍、1.5倍（P＜0.01）。輸注水楊酸鈉可輕度降低血漿FFA水平，血糖下降至IH組78%，胰島素和C肽水平也分別下降29%、26%（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠血漿FFA、葡萄糖、胰島素和C－肽水平比較（xˉ±s，n＝7）

2 三組大鼠胰腺組織中 MDA、SOD及 MDA／SOD比較 輸注脂肪乳使胰腺組織中MDA含量明顯增加，水楊酸鈉使組織中 MDA降低40%（P＜0.05）。SOD是抗氧化標(biāo)志物，與SAL組比較，IH組SOD活性增加0.4倍，水楊酸鈉對(duì)其沒有影響。進(jìn)一步用 MDA／SOD評(píng)估氧化應(yīng)激程度，IH 組 MDA／SOD是SAL組1.6倍（P＜0.01），水楊酸鈉阻斷了脂肪乳引起的MDA／SOD增高（P＜0.05），見表2。

3 三組大鼠胰腺組織中PDX－1mRNA表達(dá)比較與SAL組比較，IH組PDX－1mRNA相對(duì)表達(dá)量減少30%，水楊酸鈉使PDX－1mRNA升高20%（P＜0.05），見表2。

4 相關(guān)分析 多元線性回歸分析顯示胰腺M(fèi)DA／SOD與組織中PDX－1mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.62，P＝0.011）。

表2 三組大鼠胰腺組織內(nèi)MDA、SOD、MDA／SOD及PDX－1mRNA表達(dá)比較（ˉx±S，n＝7）

討 論

輸注脂肪乳48h，血漿FFA增加，胰島素水平升高，與C－肽升高相一致，表明高FFA增加了內(nèi)源胰島素分泌。輸注水楊酸鈉，大鼠內(nèi)源性胰島素分泌降低，血糖下降。乙酰水楊酸可促進(jìn)脂肪酸氧化，降低FFA水平［5］。本研究?jī)H觀察到水楊酸鈉對(duì)FFA有降低趨勢(shì)，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

胰腺組織抗氧化能力差，給大鼠輸注脂肪乳48h，使FFA升高，胰腺組織反映脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞受自由基攻擊損傷程度標(biāo)志物MDA含量增多，同時(shí)反映抗氧化能力的酶SOD活力也相應(yīng)增強(qiáng)，分析可能是組織對(duì)局部過度氧化的保護(hù)機(jī)制，但SOD升高比例與MDA增加比例并不平行，MDA與SOD的比率明顯增加，表明腺組織內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，活性氧簇增多（ROS）［6］。ROS類似于第二信使，可以激活多個(gè)氧化還原敏感性信號(hào)通路，進(jìn)而使胰島β細(xì)胞凋亡加速并使其功能減退［7］。PDX－1不僅是一種重要的胰島素轉(zhuǎn)錄因子，還是調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育和胰島細(xì)胞分化的核因子，PDX－1表達(dá)減少，會(huì)使胰島β細(xì)胞對(duì)凋亡因子敏感性增強(qiáng)，細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl－2和Bcl－XL減少，最終使胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)增多［8］。本研究觀察到，血漿FFA增多，可以抑制PDX－1mRNA表達(dá)，且胰腺組織中PDX－1mRNA表達(dá)量與組織內(nèi)MDA與SOD比率，即與氧化損傷的強(qiáng)度呈顯著負(fù)相關(guān)。注水楊酸鈉使MDA與SOD比率明顯下降，PDX－1mRNA表達(dá)增加。

總之，本研究證實(shí)FFA增高引起胰腺組織氧化應(yīng)激增強(qiáng)可能是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡加速的機(jī)制之一。應(yīng)用水楊酸鈉胰腺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱，PDX－1mRNA表達(dá)增加，抗炎藥水楊酸鈉可能通過降低胰腺氧化應(yīng)激而發(fā)揮保護(hù)胰島β細(xì)胞功能的作用。

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