重組可逆轉(zhuǎn)水蛭素制備及活性測(cè)定

黃 程，李紅亮，馮一建，陳 勇，陳海容，王 林，范 開(kāi)，

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院重慶 400054;2.重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司 ，重慶 400041)

水蛭素(Hirudin)是醫(yī)用水蛭(Hirudo medicinals)的唾液腺分泌的一種活性多肽，是目前已知的自然界中最強(qiáng)的抗凝血因子。水蛭素與凝血酶親和力極高，能以摩爾比1∶1結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物［1］。水蛭素與凝血酶結(jié)合后，使凝血酶失去裂解纖維蛋白原為纖維蛋白的能力，并阻止纖維蛋白的凝固和凝血酶催化的止血反應(yīng)以及凝血酶誘導(dǎo)的血小板反應(yīng)，達(dá)到抗凝目的［2］。重組水蛭素與凝血酶結(jié)合后具有不可逆轉(zhuǎn)性。臨床研究表明，重組水蛭素在治療HIT(肝素介導(dǎo)的血小板減小癥)病人時(shí)，出血率為 18.8% ～20.4%［3］，在進(jìn)行預(yù)防全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)時(shí)，深靜脈血栓的出血率為17.0%。該出血副作用限制了重組水蛭素在臨床上的廣泛應(yīng)用［4］。

比伐盧定(Bivalirudin)是通過(guò)化學(xué)合成的含20個(gè)氨基酸的水蛭素衍生物，是直接的、特異的、可逆性的凝血酶抑制劑。臨床結(jié)果表明，比伐盧定幾乎無(wú)出血風(fēng)險(xiǎn)。比伐盧定C端12個(gè)氨基酸為凝血酶識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)，N端的D-Phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4區(qū)域是與凝血酶活性區(qū)相互作用的位點(diǎn)，二者與游離型或與結(jié)合型凝血酶催化位點(diǎn)和底物識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，從而直接抑制凝血酶的活性［5］。因凝血酶可水解比伐盧定Arg3和Pro4之間的肽鍵，使其失去抗凝活性，所以比伐盧定對(duì)凝血酶的抑制作用可逆而短暫［6］。

水蛭素分子如蝌蚪狀，由2個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域組成:頭部N端為球狀致密結(jié)構(gòu)，它與凝血酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，抑制其催化活力;尾部C端主要為帶負(fù)電的羧基末端，與凝血酶的陰離子結(jié)合外側(cè)位點(diǎn)(即纖維蛋白原識(shí)別位點(diǎn)，F(xiàn)RE)結(jié)合，抑制凝血酶與纖維蛋白原的相互作用。水蛭素分子頭部和尾部之間存在一個(gè)指狀結(jié)構(gòu)從復(fù)合物中部突出，不與凝血接觸，屬功能非必需區(qū)，不參與凝血酶的抑制作用［7－9］。

由于N端引入了D-Phe-Pro-Arg-Pro的結(jié)構(gòu)，因此比伐盧定具有可逆轉(zhuǎn)性。D-Phe-Pro-Arg-Pro的結(jié)構(gòu)可被凝血水解，水解后比伐盧定喪失抗凝活性，從而使凝血酶活性恢復(fù)。本研究將水蛭素的指狀區(qū)域第45位至第48位氨基酸Thr-Pro-Lys-Pro替換為 Phe-Pro-Arg-Pro，通過(guò)重組構(gòu)建和表達(dá)，獲得與比伐盧定類似的能夠被凝血酶降解且保留原水蛭素活性的新型可逆轉(zhuǎn)水蛭素(命名為G4-HV1)，避免了重組水蛭素在臨床應(yīng)用時(shí)的出血風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

質(zhì)粒pPIC9和pPIC9K、大腸桿菌TOP10F’和畢赤酵母GS115，以及天然水蛭素(WT-HV1)均由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司保存;比伐盧定(Bivalirudin)由成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供;基因合成、測(cè)序及克隆所需的工具酶均購(gòu)自于寶生物(大連)有限公司;凍干人凝血酶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中檢所;Chromozyme TH(生色底物)購(gòu)于Roche;Phenyl Sepharose 6 Fast Flow購(gòu)于Amersham pharmacia biotech;C18 柱(XB-C18，5 μm，10 mm×150 mm)來(lái)自Welch Material;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)G4-HV1的cDNA序列，同時(shí)設(shè)計(jì)5’和3’端酶切位點(diǎn)為 Xho I和Not I，送由寶生物(大連)有限公司全基因合成，插入pMD-19T載體，命名為pMD-19T-G4-HV1。

用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切空白質(zhì)粒pPIC9和pMD-19T-G4-HV1，回收雙酶切空白質(zhì)粒pPIC9后約8 000 bp片段，以及pMD-19T-G4-HV1約200 bp的片段。連接回收的2個(gè)片段轉(zhuǎn)入TOP10F’，用LB+Amp平板篩選重組子，然后用SalⅠ和SacⅠ切下經(jīng)鑒定的pPIC9-G4-HV1上約3 000 bp片段，插入經(jīng)相同酶切的pPIC9K上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pPIC9K-G4-HV1，經(jīng)酶切鑒定后送寶生物(大連)有限公司測(cè)序。

1.2.2 電轉(zhuǎn)化酵母

將SacⅠ線性化測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pPIC9KG4-HV1進(jìn)行濃縮，然后電轉(zhuǎn)入宿主菌Pichia pastrois GS115，鋪于MD(1.34%YNB，4 ×10-5%Biotin，2%Dextrose，1.5%Agar)平板，篩選陽(yáng)性克隆。濃縮、電轉(zhuǎn)及篩選具體操作方法見(jiàn)Invitrogen Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊(cè)。

1.2.3 高表達(dá)菌種篩選

由于pPIC9K載體帶有Kanamycin抗性基因，能使陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生Geneticin(G418)抗性，且抗性隨整合到宿主菌上的外源基因的增加而增加［10］，因此選用1 ～5 g/L G418的YPD平板來(lái)進(jìn)行篩選。挑取單菌落分別點(diǎn)于含不同濃度的G418 YPD平板，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。隨機(jī)挑取在不同濃度G418的YPD平板上長(zhǎng)出的重組子菌落，接種于含100 Ml BMGY培養(yǎng)液的1 000 mL搖瓶中，30℃搖床培養(yǎng)16～20 h。至 A600為2～6時(shí)加入BMMY培養(yǎng)液100 mL，30℃繼續(xù)培養(yǎng)24～96 h。每隔 24 h取樣，并補(bǔ)入 0.5%甲醇。用SDS-PAGE監(jiān)測(cè)G4-HV1表達(dá)情況。

1.2.4 純化

搖床表達(dá)菌液經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心后，收集上清液。按1 mol/L補(bǔ)入(NH4)2SO4，進(jìn)行phenyl柱純化。用不同濃度(NH4)2SO4進(jìn)行洗脫。將洗脫后的樣品通過(guò)Welch C-18柱進(jìn)行反相純化，流動(dòng)相:A液為5%乙腈，95%水，0.1%TFA;B液為95%乙腈，5%水，0.1%TFA。經(jīng) 0～40%，30 min梯度洗脫。流速為 2 mL/min，在波長(zhǎng)280 nm下進(jìn)行檢測(cè)，以獲得G4-HV1。

1.2.5 生物學(xué)活性測(cè)定

分別取:50 mM Tris-HCL、0.1%PEG6000、pH值為7.8的chromozym TH溶液，用稀釋液溶解稀釋chromozym TH為2 mM。用稀釋液溶解稀釋凝血酶為20 IU/ml制成凝血酶溶液。供試樣品稀釋至1 mg/mL。按 1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800 稀釋，每個(gè)樣品取樣 50 μL 于96孔酶標(biāo)板，每個(gè)梯度3個(gè)復(fù)孔，再分別加入50 μL凝血酶溶液，置37℃保溫5 min。分別加入50 μL chromozym TH溶液，置37℃保溫2 min。分別加入250 μL乙酸終止反應(yīng)，再補(bǔ)加600μL蒸餾水，測(cè)定OD405值。以水蛭素含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作一條線性直線，計(jì)算直線橫坐標(biāo)截距，即為一個(gè)抗凝單位水蛭素量。以此計(jì)算水蛭素比活性。

1.2.6 G4-HV1與凝血酶結(jié)合動(dòng)力學(xué)

分別取 50 mM Tris-HCL，0.1%PEG6000，pH值為7.8的溶液配制成2.0 μg/mL 的BivalirudinWT-HV1 和 G4-HV1 各500 μL，與人凝血酶(20.0 IU/mL)500 μL 混合。37 ℃水浴作用 0、5、10、20、30、60 min后，取出置冰上。取每個(gè)稀釋度50 μL樣品于96孔酶標(biāo)板中(復(fù)孔)，再分別加入50μL人凝血酶(20 IU/mL)，置37℃保溫5 min。每孔再加入 50 μL chromozym TH 生色底物試劑(2 mM，Roche公司出品)，37℃反應(yīng)2 min。每孔加入25 μL乙酸終止反應(yīng)，405 nm測(cè)定OD值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pPIC9k-G4-HV1的酶切結(jié)果(圖1)和寶生物(大連)有限公司序列測(cè)定結(jié)果表明，所構(gòu)建的質(zhì)粒的序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致，因此成功構(gòu)建了pPIC9k-G4-HV1表達(dá)質(zhì)粒。由于質(zhì)粒pPIC9k上有2個(gè)Xho I的酶切位點(diǎn)，所以需先將目的基因轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pPIC9中，然后再經(jīng)過(guò)Sac I和Sal I雙酶切轉(zhuǎn)入pPIC9k中。

圖1 pPIC9k-G4-HV1質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

2.2 重組轉(zhuǎn)化子的表達(dá)

搖床表達(dá)菌液取1 mL離心，留上清用TCA法沉淀做電泳分析(圖2)。電泳結(jié)果表明，成功表達(dá)出G4-HV1。挑取表達(dá)量相對(duì)較高的7號(hào)進(jìn)行搖床培養(yǎng)表達(dá)。

圖2 搖床表達(dá)結(jié)果

2.3 純化

5 L表達(dá)菌液，離心收集上清，經(jīng)疏水柱及反相C-18柱純化。將獲得的G4-HV1進(jìn)行RPHPLC分析和質(zhì)譜分析(LC/MSD SL質(zhì)譜儀，Aglient Technologies公司出品)測(cè)定分子量，結(jié)果表明G4-HV1純度可達(dá)95%以上(圖3)。分子量測(cè)定結(jié)果與理論分子量一致。

圖3 RP-HPLC分析制備樣品結(jié)果

2.4 G4-HV1抗凝活性及可逆轉(zhuǎn)性測(cè)定

1)G4-HV1抗凝活性的測(cè)定。取G4-HV1，按比例稀釋，用TH法測(cè)定得到G4-HV1的抗凝活性約為14 000 ATU(圖4)，WT-HV1的抗凝活性約為15 000 ATU(抗凝活性數(shù)據(jù)由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司提供)。

圖4 TH法測(cè)定G4-HV1的抗凝活性

2)G4-HV1與凝血酶結(jié)合動(dòng)力學(xué)。如圖5，經(jīng)生色底物法測(cè)定后，比伐盧定100%可逆轉(zhuǎn)(與文獻(xiàn)報(bào)道相符)［11］，G4-HV1可逆轉(zhuǎn)性為 30% ～40%，而天然水蛭素完全不可逆轉(zhuǎn)。

圖5 TH法測(cè)定G4-HV1與凝血酶結(jié)合動(dòng)力學(xué)

3 討論

經(jīng)上游構(gòu)建篩選、表達(dá)、純化和質(zhì)譜鑒定得到了純度95%以上的G4-HV1，生色底物法測(cè)定G4-HV1的抗凝活性約為14 000 ATU，與凝血酶結(jié)合動(dòng)力學(xué)表明G4-HV1的可逆轉(zhuǎn)性為30%～40%。

G4-HV1的抗凝活性約為14 000 ATU，與水蛭素(約15 000 ATU)的活性基本無(wú)差異。本研究結(jié)果再次證明，水蛭素主要活性區(qū)域?yàn)镹端球形區(qū)和C端纖維蛋白原結(jié)合區(qū)，指狀區(qū)域?qū)钚詭谉o(wú)影響。但是將水蛭素的第45位至48位氨基酸替換為 Phe-Pro-Arg-Pro后，G4-HV1的可逆轉(zhuǎn)性為30%～40%，未出現(xiàn)比伐盧定樣100%可逆轉(zhuǎn)性。初步推測(cè)可能有2個(gè)原因:①水蛭素N端是由40多個(gè)氨基酸組成的球狀致密結(jié)構(gòu)，使其與凝血酶結(jié)合更緊密，雖然中間的指狀區(qū)域被替換，但是由于空間位阻的影響，凝血酶的酶切的效率較低，從而G4-HV1的可逆轉(zhuǎn)只有30% ～40%;② 由于比伐盧定N端第1個(gè)氨基酸為D型，有研究［12］表明，比伐盧定N端的D型氨基酸有助其被凝血酶水解，而通過(guò)酵母表達(dá)的則為L(zhǎng)型，所以G4-HV1的可逆轉(zhuǎn)相對(duì)比伐盧定低。

本文所研究的G4-HV1可逆轉(zhuǎn)性相對(duì)較低，下一步將通過(guò)分子模擬結(jié)合實(shí)驗(yàn)，將G4-HV1第41位至44位或第49位至52位的氨基酸改為柔性較強(qiáng)的甘氨酸，使指狀區(qū)域暴露更充分，更利于凝血酶酶切，使可逆轉(zhuǎn)水蛭素活性喪失更迅速，凝血酶活性恢復(fù)更快，進(jìn)一步提高可逆轉(zhuǎn)水蛭素的可逆轉(zhuǎn)性。

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