聚合物分離介質(zhì)在多肽分離中的應(yīng)用

姜 和，付訓(xùn)忠，閔文杰

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.重慶前沿生物技術(shù)有限公司，重慶 400041)

多肽類藥物的研究與開發(fā)是我國21世紀(jì)生物醫(yī)藥研究的重點方向之一。許多多肽對人的生理與病理過程，疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療有著重要意義，在臨床上具有巨大的應(yīng)用價值。然而在多肽類藥物的研究與開發(fā)中，往往因在下游的分離與純化過程中所存在的技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致難以獲得令人滿意的目標(biāo)多肽或制備規(guī)模。近年來一類新型的聚合物分離介質(zhì)因其良好的分離效果、穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)及高吸附載量，在多肽類藥物的分離與純化中得到越來越廣泛的應(yīng)用，也為多肽的分離介質(zhì)選擇提供了新的途徑。

目前，在多肽分離純化中最常用的分離介質(zhì)是以硅膠為基質(zhì)的反相填料(如 C4、C8、C18等)，然而以C18為代表的反相硅膠填料存在穩(wěn)定性差、pH值使用范圍窄(pH值為2～8)、易污染、難以清洗和再生等缺點，同時在反相體系中多肽會帶有電荷，易被硅膠表面所帶的硅醇基吸附，導(dǎo)致出現(xiàn)峰型展寬、拖尾等不利影響［1－2］。此外，一些堿性多肽在酸性條件下不能被分離，而只有在堿性條件下才能夠被分離。為了克服反相硅膠分離介質(zhì)固有的缺陷，學(xué)者們把注意力轉(zhuǎn)向了一類新型的聚合物分離介質(zhì)。此類分離介質(zhì)的pH值使用范圍大(pH值為1～14)，在強(qiáng)酸及強(qiáng)堿溶液體系中化學(xué)穩(wěn)定性和粒徑均一性好。其中在多肽分離中應(yīng)用最多的反相聚合物分離介質(zhì)表面無極性，不含鍵合的烷基官能團(tuán)和殘留的硅醇基，不易產(chǎn)生不可逆的吸附作用，并且能有效保持生物樣品的活性，可代替反相硅膠應(yīng)用于多肽類物質(zhì)的分離純化［3－4］。此外這些分離介質(zhì)還能抵御極端條件下的在線清洗。在高pH值條件下的反相分離能夠使分離度增加，并且提高堿性樣品的溶解度［5－11］。

1 聚合物分離介質(zhì)的發(fā)展、分類與性能

自20世紀(jì)60年代以來，聚合物作為色譜介質(zhì)已被用于生物大分子的分離［12］。但受限于聚合技術(shù)等因素，早期的聚合物剛性較差，只能在低壓、低流速下使用，不能用于高效液相色譜分析，且分離能力不佳，難以應(yīng)用于藥物的精細(xì)分離?；瘜W(xué)鍵合相硅膠介質(zhì)(如常用的C18介質(zhì))很好地彌補(bǔ)了聚合物介質(zhì)剛性不足、分離能力有限等缺點，成為廣泛應(yīng)用于多肽的反相高效液相色譜分離介質(zhì)［13－15］，但此類介質(zhì)化學(xué)穩(wěn)定性差，在強(qiáng)酸或堿性環(huán)境中長期使用會造成鍵合相脫落或基質(zhì)溶解，嚴(yán)重影響色譜柱的分離效果和使用壽命。與使用范圍限于pH值為2～8的硅膠類介質(zhì)相比，聚合物分離介質(zhì)不僅能耐受低pH值溶液，還能用NaOH溶液清洗和再生，更適用于多肽等生物分子在反相色譜中的分離，因此，近年來具有高機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)異分離性能及良好化學(xué)穩(wěn)定性的聚合物分離介質(zhì)又重新引起了科研工作者的關(guān)注。

按照聚合基體的不同，聚合物可以分為聚苯乙烯型和甲基丙烯酸型，分別是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯為聚合單體，加入致孔劑聚合而成。早期的聚合物分離介質(zhì)因孔徑較大，稱為大孔吸附樹脂，其性質(zhì)介于天然吸附劑(活性炭、硅膠和硅藻土)和離子交換劑之間，其吸附特性與天然吸附劑類似，比離子交換劑更容易再生，是吸附性和分子篩性原理相結(jié)合的分離介質(zhì)［16］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)表面帶或不帶有不同極性的功能基，可分為非極性、中極性和極性3類［17］。目前大孔吸附樹脂已廣泛應(yīng)用于中藥提取液及多肽的分離純化。但因大孔吸附樹脂本身粒徑較大等因素導(dǎo)致其分離能力較低，在物質(zhì)的精細(xì)分離純化中很難達(dá)到所需的純化要求及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。近年來隨著聚合技術(shù)的發(fā)展，新型的精細(xì)聚合物分離介質(zhì)隨之誕生。精細(xì)聚合物分離介質(zhì)一般是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯為單體聚合而成，其粒徑分布為數(shù)微米至數(shù)十微米，比表面積達(dá)到600 m2/g，具有更好的粒徑分布、更小的平均粒徑和更高的比表面積，因此擁有更好的分離度和更高的吸附載量，加上其優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性，在多肽等生物分子的反相分離純化中的應(yīng)用也越來越廣泛，且制備規(guī)模也越來越大。

合成聚合物介質(zhì)的方法有種子聚合法、分散聚合法、懸浮聚合法和乳液聚合法等［18］。根據(jù)欲分離的蛋白多肽特性，可以在聚合物的基礎(chǔ)上鍵合所需基團(tuán)制成相應(yīng)的分離介質(zhì)(如離子交換層析介質(zhì))。在分離制備柱的類型上，也可以將制備柱制成顆粒預(yù)裝柱或單體柱。其中單體柱是將聚合單體原地裝入所需柱體內(nèi)，再加入交聯(lián)劑與致孔劑制成結(jié)構(gòu)上的單體柱。相對于傳統(tǒng)的顆粒預(yù)裝柱，單體柱的使用不常見，但因其具有相對簡單的聚合技術(shù)、良好的流體動力學(xué)特性及較小的傳質(zhì)阻抗，使其在多肽微量規(guī)模的分離純化中的應(yīng)用較多。

2 聚合物分離介質(zhì)的應(yīng)用

2.1 大孔吸附樹脂的應(yīng)用

大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一類最早應(yīng)用于物質(zhì)分離的有機(jī)高分子聚合物吸附劑，因其良好的選擇性吸附性能，使其早期被廣泛應(yīng)用于工業(yè)脫色、環(huán)境保護(hù)、天然植物中活性成分提取等領(lǐng)域［13］。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，使得大孔吸附樹脂在生物活性物質(zhì)生產(chǎn)上的應(yīng)用逐漸增多。該樹脂的優(yōu)點在于在提取酶、氨基酸、蛋白質(zhì)、肽等時的條件溫和，設(shè)備簡單，操作方便，可避免有機(jī)溶劑帶來的環(huán)保、成本昂貴等問題，還可以避免由于加熱、化學(xué)處理過程而造成生物活性降低。徐世芳等［19］在酪蛋白非磷肽的分離過程中，篩選了12種大孔吸附樹脂，發(fā)現(xiàn)其中DA201－C大孔吸附樹脂可以非常好地吸附酪蛋白非磷肽，去除其中的無機(jī)鹽，酪蛋白非磷肽的回收率可達(dá)到95%。唐成康等［20］采用D101大孔吸附樹脂，從山茱萸干果中提取到粗提物，再經(jīng)SP Sepharose和Sephacryl S－300柱層析，得到一種具有抑制α－淀粉酶活性的糖蛋白(CoGP)。但隨著藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高，以及蛋白多肽類藥物自身特殊性，使得大孔吸附樹脂在蛋白多肽類藥物的分離純化上的應(yīng)用受到了極大的限制。蛋白多肽類藥物的給藥途徑一般為注射給藥，其對藥品本身的安全性要求很高，而一般的大孔吸附樹脂在聚合過程中加入的聚合單體與致孔劑會產(chǎn)生許多有毒的有機(jī)殘留物，如苯、苯乙烯和二乙烯苯等，即使在后期的樹脂預(yù)處理過程中也很難將這些有機(jī)殘留物完全除掉。而這類殘留物大部分屬于一類有毒有機(jī)溶劑，因此極大地限制了其在蛋白多肽類，以及通過注射給藥的藥物分離純化上的應(yīng)用。但近年來國外科研工作者通過改進(jìn)聚合技術(shù)研發(fā)出吸附力強(qiáng)、殘留低的聚合樹脂，如Rohm－Hass(羅門哈斯)生產(chǎn)的XAD系列、Organo(三菱化學(xué))生產(chǎn)的HP系列等。這些吸附樹脂在有機(jī)殘留物的控制中能夠達(dá)到很高的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。其中Rohm－Hass的XAD16系列樹脂還通過了美國FDA認(rèn)證，使得其能夠安全地應(yīng)用于蛋白多肽類藥物的分離純化，也為大孔吸附樹脂應(yīng)用于注射給藥類藥物的分離純化開創(chuàng)了先例。

2.2 精細(xì)聚合物分離樹脂的應(yīng)用

雖然有機(jī)殘留低的大孔吸附樹脂的出現(xiàn)，使得其在蛋白多肽類藥物的分離純化上的應(yīng)用有了安全性的保障，但大孔吸附樹脂的大孔徑致使其分離能力受到限制，難以達(dá)到所需的分離能力，更難以應(yīng)用于蛋白多肽類藥物的精細(xì)分離。直到20世紀(jì)90年代，包括Rohm－Hass的CG與XT系列及Organo的CHP系列等在內(nèi)的精細(xì)分離樹脂的開發(fā)成功，才使得上述局面得以打破。此類精細(xì)分離樹脂的優(yōu)點在于粒徑更小(分析型的平均粒徑可以達(dá)到4 ～10 μm，制備型為20 ～100 μm)，比表面積大，均一系數(shù)高，剛性強(qiáng)度高，再結(jié)合聚合物本身的化學(xué)穩(wěn)定性高，pH值適用范圍廣，吸附載量高等諸多優(yōu)勢，使得該類樹脂近年來在植物有效成分、多肽、生長因子、酶、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的分離純化中的應(yīng)用越來越普遍，也取得了很好的分離效果，且可以放大至制備規(guī)模［21－23］。Jamil Mohammad 等［24］使用粒徑 5 μm 的聚乙烯苯 － 二乙烯基苯聚合物預(yù)裝柱(150 mm ×4.6 mm I.D)，在pH值為2～12的溶液中對血管緊張素肽混合物進(jìn)行了分離條件研究的實驗。實驗結(jié)果表明，在以乙腈為洗脫液的反相分離條件和pH值為12(10mM/NaOH)的條件下多肽混合物得到了很好的分離，且分離度高于其他酸性溶液。Michiel H.M等［25］利用聚苯乙烯苯－二乙烯基苯聚合單體柱，在LC/MS模式下對其應(yīng)用于蛋白降解物分析的可能性進(jìn)行了研究。使用不同柱長的制備柱對含有9種蛋白混合物的蛋白降解物進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)隨著柱長的增加，其峰容量明顯增加。Quanzhou Luo 等［26］使用 10 μm 粒徑的聚乙烯苯－二乙烯基苯聚合物制成的多孔開管式開放柱與強(qiáng)離子交換柱和質(zhì)譜串聯(lián)形成在線三維俘獲柱，應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的超痕量物質(zhì)研究。研究表明，在使用上述三維俘獲柱對一種宮頸癌細(xì)胞株差異凝膠胰蛋白酶的降解物進(jìn)行分離與分析時，最終包括癌癥相關(guān)蛋白(如MAP激酶)的5047種多肽的1857種獨立蛋白被識別與鑒定。

相對于聚苯乙烯型分離介質(zhì)，甲基丙烯酸型分離樹脂的研究起步較早，且多以聚合成的單體柱應(yīng)用于物質(zhì)的分離。從反相分離性能上比較來看，甲基丙烯酸型反相分離樹脂的疏水性要低于聚苯乙烯型反相分離樹脂，其在植物有效成分、酶及蛋白多肽的分離純化上也有很好的應(yīng)用。Lee等［27］使用甲基丙烯酸聚合而成的單體毛細(xì)管柱對核糖核酸酶A、細(xì)胞色素C、肌紅蛋白、卵清蛋白混合物進(jìn)行分離，在優(yōu)化了的梯度洗脫條件下混合物得到了很好的分離。

我國在聚合物分離樹脂上的研究相對于國外起步較晚，但近年來也相繼開發(fā)出國產(chǎn)的聚合物分離樹脂，并成功應(yīng)用于包括蛋白多肽類在內(nèi)的各種生物大分子的分離純化。邵承偉等［28］采用聚苯乙烯－二乙烯基苯(PS－DVB)型麥科菲反相高效液相色譜柱 (MKF－RP－MH)對胸腺素 α1(Tα1)進(jìn)行分離，采用乙腈為洗脫液進(jìn)行反相梯度洗脫，在優(yōu)化色譜條件(流動相A:0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.0或8.0;流動相B:乙腈，梯度洗脫條件 0～20 min，0～10%乙腈，20～30 min，10% ～30% 乙腈;溫度:30℃;流速:0.8 mL/min;檢測波長:214 nm)下分離了胸腺素α1標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。樣品濃度在0.05～4.00 g/L時，線性方程為 C=0.0099A －0.078，r=0.9904，胸腺肽α1最大載量為6 g/L。實驗結(jié)果表明:聚合物型MKF－RP－MH反相色譜柱可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的C18硅膠柱，很好地應(yīng)用于Tα1的分離純化。

3 反相聚合物型分離介質(zhì)與反相硅膠(C18)在蛋白多肽分離純化應(yīng)用上的比較

3.1 應(yīng)用于分離純化所存在的優(yōu)勢

1)化學(xué)穩(wěn)定性高。目前傳統(tǒng)的C18反相硅膠填料是以硅膠為基體，鍵合上疏水基團(tuán)，其pH值適用范圍基本在2～8，pH值偏高或者偏低都會對填料本身產(chǎn)生損傷。特別是當(dāng)pH偏高時硅膠基體會發(fā)生明顯的溶解。而反相聚合物分離介質(zhì)是以聚合單體為基體，加入交聯(lián)劑聚合而成，沒有鍵合相，在pH值為1～14的條件下都具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性。因此對于那些在堿性條件下具有良好分離效果的蛋白多肽混合物，反相聚合物分離樹脂具有明顯的穩(wěn)定性優(yōu)勢。

2)吸附載量高。對于制備規(guī)模的混合物的分離純化，分離介質(zhì)的吸附載量的高低在很大程度上決定著分離純化的效率與成本。相對于C18反相硅膠，反相聚合物分離介質(zhì)在吸附能力上具有明顯的優(yōu)勢。如在使用Rohm－Hass的CG系列反相樹脂對牛血清蛋白進(jìn)行分離實驗時發(fā)現(xiàn)［29］:其有效分離載量基本達(dá)到30 mg/mL，且隨著載樣流速的增加，其有效分離吸附載量沒有明顯的變化;而 C18反相硅膠的有效分離吸附載量為10 mg/mL，當(dāng)載量繼續(xù)增大時其分離效果明顯降低。

3)與C18在多肽的分離上具有很好的互補(bǔ)性。精細(xì)聚合物反相分離樹脂的出現(xiàn)使得聚合物分離填料應(yīng)用于蛋白多肽的分離純化成為現(xiàn)實。對于C18反相硅膠填料較難分離的復(fù)雜多肽混合物，精細(xì)樹脂可能具有更好的選擇性。王靜等［15］以二乙烯基苯為原料，采用微孔膜乳化－懸浮聚合法制備了粒徑為25 μm的聚二乙烯基苯(PDVB)微球，考察了PDVB介質(zhì)的物理性能及其作為半制備級反相高效色譜填料的分離性能和應(yīng)用潛力，并且對PDVB微球在多肽分離上的性能進(jìn)行了實驗研究。實驗以催產(chǎn)素、血管緊張素Ⅱ、血管緊張素Ⅰ和胰島素的混合溶液為樣品，在以TFA作為離子對試劑的條件下反相梯度洗脫分離，并且與相同粒徑的商品化的C18球形介質(zhì)進(jìn)行了對比。實驗結(jié)果表明:PDVB半制備柱對4種多肽的混合物能完全分離，各相鄰兩色譜峰的分離度均大于1.5，各峰的拖尾因子均在 1.00 ～1.35，峰形較對稱，理論塔板數(shù)最高可達(dá)21000 m－1;而C18介質(zhì)分離譜圖峰形較寬，分離度及理論塔板數(shù)均不及PDVB介質(zhì)，尤其是對于血管緊張素II和血管緊張素I，二者之間僅相差2個氨基酸殘基，用C18介質(zhì)難以將二者很好分離。PDVB介質(zhì)實現(xiàn)了對二者的完全分離，說明在血管緊張素等多肽藥物的分離純化領(lǐng)域，PDVB介質(zhì)有著很好的分離效果。

4)填料易于裝填與再生。作為中低壓分離介質(zhì)，反相聚合物分離樹脂更易于裝填，而不需要像C18反相硅膠裝填時所需的高壓和特殊裝填設(shè)備，更利于實驗室研究制備規(guī)模的擴(kuò)大和工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 應(yīng)用于分離純化所存在的缺陷

雖然隨著聚合技術(shù)的發(fā)展，聚合物分離介質(zhì)的剛性有了很大的改善，其耐壓能力也相應(yīng)有了很大的提高，但相對于包括C18在內(nèi)的反相硅膠填料，其最大耐壓能力仍低很多，因此也導(dǎo)致在裝填時所允許的最大裝填壓力低很多，最終導(dǎo)致分離能力的下降。即使在相同粒徑的情況下，聚合物分離介質(zhì)也往往難以達(dá)到與反相硅膠相同的分離能力水平。

4 結(jié)束語

進(jìn)入21世紀(jì)以來，生物醫(yī)藥技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，各種具有治療作用的蛋白多肽類物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，因此分離純化這項下游技術(shù)在推動其產(chǎn)業(yè)化過程中顯得尤為重要。聚合物分離介質(zhì)的出現(xiàn)無疑為蛋白多肽類物質(zhì)分離純化介質(zhì)的選擇提供了一條新途徑。聚合物分離介質(zhì)自身所特有的高化學(xué)穩(wěn)定性、高吸附載量彌補(bǔ)了傳統(tǒng)反相硅膠填料的許多不足。近年來的研究與應(yīng)用表明:聚合物分離介質(zhì)在蛋白多肽類物質(zhì)分離純化中具有廣泛的應(yīng)用前景，并日益顯示出其獨特的作用與優(yōu)勢。相信隨著研究的深入，不斷涌現(xiàn)的各種性能更加優(yōu)良的聚合物分離介質(zhì)必將和其他各種分離介質(zhì)一起推動著蛋白多肽類藥物的研發(fā)，為生物醫(yī)藥技術(shù)的進(jìn)步作出貢獻(xiàn)。

［1］Sychov C S，Ilyin M M，Davankov V A，et al.Elucidation of retention mechanisms on hypercrosslinked polystyrene used as column packing material for high－performance liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，2004，1030:17－24.

［2］Zhelev N Z，Barratt M J，Mahadevan L C.Use of reversed－phase high－performance liquid chromatography on polystyrene－divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid－soluble nuclear proteins［J］.J Chromatogr A，1997，763:65 －70.

［3］Marjors R E.High－speed analyses using rapid resolution liquid chromatography on 1.8－microm porous particles LC GC［J］.Asia Pacific，2003，6(1):8 －12.

［4］Lloyd L L.Ion suppression reversed－phase high－performance liquid chromatography method for the separation of L－ascorbic acid in fresh fruit juice ［J］.J Chromatogr，1991，544:201 －217.

［5］Bennjet H P.Isolation of pituitary peptides by reversedphase high－performance liquid chromatography.Expansion of the resolving power of reversed－phase columns by manipulating pH and the nature of the ion－pairing reagent［J］.J Chromatogr，1983，266:501.

［6］Hearn M T，Aguilar M I.High－performance liquid chromatography of amino acids，peptides and proteins.LXVII.Evaluation of bandwidth relationships of peptides related to human beta－endorphin，separated by gradient－elution reversed－phase high－performance liquid chromatography［J］.J Chromaogr，1986，352:35.

［7］Tanaka N，Kimata K，Mikawa Y，et al.Performance of wide－pore silica－and polymer－based packing materials in polypeptide separation:effect of pore size and alkyl chain length ［J］.J Chromatogr，1990，538:13.

［8］Manning J N，Sullivan G S，Davis P F.Reversed－phase liquid chromatography of elastin peptides［J］.J Chromatogr，1989，487:41.

［9］Linde S，Welinder B S.Non－ideal behaviour of silicabased stationary phases in trifluoroacetic acid－acetonitrile－based reversed－phase high－performance liquid chromatographic separations of insulins and proinsulins［J］.J Chromatogr，1991，536:43.

［10］Ricker R D，Sandoval L A，Permar B J.Improved reversed－phase high performance liquid chromatography columns for biopharmaceutical analysis［J］.J Pharm Biomed Anal，1995，14:93.

［11］Visualising intraparticle protein transport in porous adsorbents by confocal microscopy.Renlund S.Application Note［P］.18－1130－93，Amersham Pharrmacia Biotech，Uppsala，1998.

［12］Sober H A，Peterson E A.Studies on the coenzyme activation of glutamic－aspartic apotransaminase.Chromatography of Proteins on Cellulose Ion－exchangers［J］.J Am Chem Soc，1954，76:1711 －1712.

［13］白泉，葛小娟，耿信篤.反相液相色譜對多肽的分離、純化與制備［J］.分析化學(xué)研究簡報，2002(9):1126－1129.

［14］黃鶴，萬里鵬，吳蕾，等.液相色譜法分離純化固相合成的胸腺素 α1［J］.化學(xué)工業(yè)與工程，2001，18(6):331 －335，353.

［15］WANG Jin，QU Huan－h(huán)uan，HAO Dong－xia，et al.Preparation of Uniform Polydivinylbenzene Microspheres and Their Application in Reversed－phase Chromatographic Separation of Small Molecular Compounds and Peptides［J］.The Chinese Journal of Process Engineering，2009，9(4):763.

［16］宮霞，趙俊.大孔吸附樹脂對酪蛋白酶解液的脫鹽作用研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(11):302.

［17］LIU Fei，ZHAO Ying.Macroporous absorbed resin and it’s application in separation and purification of natural product［J］.Qilu Pharmaceutical Affaira，2008，27(10):679.

［18］Ohtsuka Y，Kawaguch H，Sugi Y.copolymerization of Styrene with Acrylamide in all Emulsifier－flee Aqueous Medium［J］.J Appl Polym SCi，198，26:1637 －1647.

［19］徐世芳，毛麗珍.大孔吸附樹脂及其在中藥化學(xué)成分純化中的應(yīng)用［J］.浙江省醫(yī)藥科學(xué)院學(xué)報，2001(6):45－47.

［20］唐成康，高小平，徐大勇.山茱萸糖蛋白的純化及部分理化性質(zhì)研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(2):147－151.

［21］Cartier P G，Deissler K C，Maikner J J.The utility of polymeric reversed phase packings for the purification of peptides，proteins and antibiotics［M］.London，UK:Elsevier，1990:275－84.

［22］Cartier P G，Deissler K C，Maikner J J.Characterization of a family of polymeric resins with average pore diameters of 150，300，and 1000 for the preparative reverse phase purification of polypeptides［J］.Separations for Biotechnology，1994，158(3):100.

［23］Kinzey M，Deissler K，F(xiàn)isher J.Strategies for Optimizing Peptide Purifications Using Amberchrom CG300SEuropean Forum on Advances［C］//Industrial Downstream Processing.Stuttgart，Germany:［s.n.］，1998:13 －15.

［24］Jamil Mohammad，Bj?rn J?derlund，Hans Lindblom.New polymer－based prepacked column for the reversed－phase liquid chromatographic separation of peptides over the pH range 2 － 12［J］.J Chromatography A，1999，852:255－259.

［25］Michiel H M，van de Meent，Sebastiaan Eeltink.Potential of poly(styrene－co－divinylbenzene)monolithic columns for the LC－MS analysis of protein digests［J］.Anal Bioanal Chem，2011:399:1845－1852.

［26］Quanzhou Luo，Ye Gu，Shiaw－Lin Wu，et al.Two－dimensional strong cation exchange/porous layer open tubular/mass spectrometry for ultratrace proteomic analysis using a 10 microm id poly(styrene－divinylbenzene)porous layer open tubular column with an on－line triphasic trapping column［J］.Electrophoresis，2008，29(8):1604－1611.

［27］Lee D，Svec F，F(xiàn)rechet J M J.Photopolymerized monolithic capillary columns for rapid micro high－performance liquid chromatographic separation of proteins［J］.J Chromatogr A，2004，1051:53.

［28］Shao Cheng－Wei，Wei Rong－Qing，zhang Ting－Ting，et al.Applica tion of Poly(styrene2div inylbenzene)Resin to the Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography for the Determination of Thymosinα1［J］.Chinese journal of Analytical Chemistry，2007，35(10):1491－1495.

［29］Tanaka N，Kimata K，Mikawa Y，et al.Performance of wide－pore silica－and polymer－based packing materials in polypeptide separation:effect of pore size and alkyl chain length［J］.J Chromatogr，1990，535:13 －31.