4株何首烏根部土壤真菌產(chǎn)纖維素酶活性的研究

馬雅鴿 趙榮華 趙聲蘭

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650000

何首烏作為珍貴藥用植物始載于《開寶本草》，為寥科植物何首烏Polygonum multiflorum thumb．的干燥塊根。近年來已有大量科學(xué)研究證明，何首烏中結(jié)合型蒽醌衍生物能刺激腸道引起腸道充血性炎癥，導(dǎo)致惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等不良反應(yīng)［1］。而結(jié)合型蒽醌衍生物大多是以糖苷鍵結(jié)合的化合物［1，2］，纖維素酶有水解糖苷鍵的作用［3］。本課題組從何首烏根部土壤篩選真菌，對何首烏進(jìn)行固體發(fā)酵，找到了4株對結(jié)合型蒽醌類分解能力較強(qiáng)的真菌菌株。因此，本文對這4株真菌產(chǎn)生的纖維素酶進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 YZ3.66、YZ3.57、YZ3.23、YZ3.41從云南中醫(yī)學(xué)院關(guān)上校區(qū)種植何首烏的根部土壤及祿勸縣種植何首烏的根部土壤分離獲得。

1.2 DNS法測定纖維素酶活力

1.2.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株發(fā)酵液的制備［3］選取菌株制備孢子懸液:純化的真菌菌株在PDA斜面培養(yǎng)基上活化7d后，在斜面培養(yǎng)菌種試管中加入0．9%無菌氯化鈉溶液3～5m l，再將少許滅菌棉花塞進(jìn)試管，用吸管將其推進(jìn)試管，借助棉花將孢子推入試管下部，然后將孢子液吸出，制成孢子懸浮液，在光學(xué)顯微鏡下用紅血球計數(shù)板計數(shù)，得到終濃度為1×106CFU/ml的孢子懸液，取100μl接種于滅菌的150m l液體PDF培養(yǎng)基，28℃、110r/min振蕩培養(yǎng)液體發(fā)酵，24h后每間隔12h吸取發(fā)酵液測定不同培養(yǎng)時間下酶活力，直至168h后檢測完畢。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［3、4］準(zhǔn)確稱量1.0000g去水恒重的葡萄糖，用適量蒸餾水溶解轉(zhuǎn)移至500m l容量瓶定容，得濃度為2mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃保存。取25ml刻度試管并編號，按表1順序加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、水及DNS試劑，上述試劑混勻后，在沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min進(jìn)行顯色，然后以冷流水迅速冷卻，蒸餾水定容至25 m l，搖勻。以空白調(diào)零在UV－4802H型紫外可見分光光度計測定各反應(yīng)體系在540nm處的吸光值。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光值OD540為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得該曲線的回歸方程。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配方

1.2.3 樣品纖維素酶活力的測定［5］取25ml刻度試管置于50℃的恒溫水浴中。吸取一定稀釋度的酶溶液0.5ml加入試管中，然后再分別加入已經(jīng)預(yù)熱到50℃的0.5m l檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液和0.5ml2%的CMC溶液。另取一支25ml刻度試管，在其中加一定稀釋度的酶溶液0.5ml，經(jīng)沸水浴滅活，再加0.5m l2%CMC溶液和0.5m l緩沖液作空白。將兩試管一起50℃恒溫30min后，沸水終止反應(yīng)，搖勻吸取上清液0.5m l放入試管中，在各試管中分別加入3mlDNS。然后，將兩試管同時置于沸水浴中顯色5min，冷卻至室溫，分別用蒸餾水定容至25m l，搖勻。反復(fù)振蕩試管，靜置約20min，取每個試管中的上清液在540nm波長下測定吸光度A值。

反應(yīng)生成的葡萄糖的量根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。纖維素酶活力的按照下式計算:

一個CMC酶活力單位定義為每分鐘生成1μmol葡萄糖所需的酶量，單位:IU/m l。

1.2.4 方法學(xué)考察［6］(1)精密度試驗(yàn) 精密度是指用特定的分析程序在受控條件下重復(fù)分析同一樣品所得測定值的一致程度，它反映分析方法或測量系統(tǒng)所存在隨機(jī)誤差的大小。極差、平均偏差、相對平均偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差都可用來表示精密度大小，較常用的是標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

4個菌株樣品分別取一定的量，進(jìn)行纖維素酶活測定。將同一樣品連續(xù)測定六次，計算其葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD/%)。

(2)樣品的加標(biāo)回收率試驗(yàn) 加標(biāo)回收率即在樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定其回收率，以確定準(zhǔn)確度，多次回收試驗(yàn)還可發(fā)現(xiàn)方法的系統(tǒng)誤差，這是目前常用而方便的方法，其計算式是:回收率=(加標(biāo)試樣測定值—試樣測定值)/加標(biāo)量·100%

取一定量的樣品溶液，加入不同量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測其吸光值，并計算葡萄糖濃度，然后計算標(biāo)準(zhǔn)品的回收率。

(3)樣品中纖維素酶含量的計算 根據(jù)重復(fù)測定時所得試驗(yàn)值，4株真菌樣品中的纖維素酶的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 分別吸取培養(yǎng)120h的4個樣品稀釋后的溶液0.50ml，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表2 樣品的精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，4個樣品的精密度試驗(yàn)中，YZ3.66相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3912%，YZ3.57相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0891%，YZ3.23相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04%，YZ3.41相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4957。精密度試驗(yàn)考察的是一組測量數(shù)據(jù)間的接近程度，數(shù)據(jù)之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，說明測量結(jié)果越精確。4個樣品的精密度數(shù)值都在在誤差允許范圍5%以內(nèi)，所以說結(jié)果是可信的。

2.3 樣品的加標(biāo)回收率試驗(yàn) (準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果) 分別取培養(yǎng)168h的4株真菌稀釋溶液不同的量，然后加入不同體積的2mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測定。試驗(yàn)結(jié)果分別如表3、表4、表5、和表6所示。

由表3可以看出:YZ3.66樣品的標(biāo)準(zhǔn)品回收率平均值為100.3%，此次測定加標(biāo)回收率在允許范圍 (95～105%)內(nèi)，因此可證實(shí)此試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

由表4可以看出:YZ3.57樣品的標(biāo)準(zhǔn)品回收率平均值為99.9%，此次測定加標(biāo)回收率也在允許范圍 (95～105%)內(nèi)，因此可證實(shí)此試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

由表5可以看出:YZ3.23樣品的標(biāo)準(zhǔn)品回收率平均值為99.5%，此次測定加標(biāo)回收率也在允許范圍 (95～105%)內(nèi)，因此可證實(shí)此試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

由表6可以看出:YZ3.41樣品的標(biāo)準(zhǔn)品回收率平均值為100.1%，此次測定加標(biāo)回收率也在允許范圍 (95～105%)內(nèi)，因此可證實(shí)此試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2.4 四株真菌纖維素酶活的測定結(jié)果與討論 四株真菌纖維素酶活的測定結(jié)果如表7所示。

表3 YZ3.66樣品的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 YZ3.57樣品的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 YZ3.23樣品的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 YZ3.41樣品的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

表7 纖維素酶活力的測定結(jié)果

時間 (h) YZ3.66酶活 (IU/ml) YZ3.57酶活 (IU/ml) YZ3.23酶活 (IU/ml) YZ3.41酶活 (IU/ml)84 0.84 0.80 2.86 0.92 96 1.87 1.83 2.86 0.93 108 2.32 2.21 3.09 1.01 120 2.38 2.34 4.28 2.02 132 2.51 2.49 6.73 2.56 144 2.60 2.58 8.19 2.56 156 3.35 3.33 8.54 4.30 168 3.54 3.52 8.54 4.59

由表7可以看出:隨著培養(yǎng)時間的增加，這四個菌株的產(chǎn)酶能力都在增加，YZ3.66和YZ3.57產(chǎn)酶的增長速度近似，最終的產(chǎn)酶能力也近似;YZ3.23產(chǎn)酶速度平穩(wěn)，并且速度最快;YZ3.41前期產(chǎn)酶速度最慢，中后期加快。在同一培養(yǎng)時間內(nèi)YZ3.23菌株產(chǎn)纖維素酶活性最大，YZ3.41菌株次之，YZ3.66菌株和YZ3.57菌株產(chǎn)纖維素酶活性接近并且最小。培養(yǎng)7天后，這4株真菌產(chǎn)纖維素酶活性分別為:YZ3.23=8.54IU/ml，YZ3.41=4.59IU/m l，YZ3.66=3.54IU/ml，YZ3.57=3.52IU/ml。

3 結(jié)論

本論文采用 DNS法對 YZ3.66、YZ3.57、YZ3.23、YZ3.41四株真菌的產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行性測定，對此方法進(jìn)行了精密度和準(zhǔn)確性的方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)此方法準(zhǔn)確可靠。經(jīng)過7天培養(yǎng)，連續(xù)測定纖維素酶活力，發(fā)現(xiàn)這四株真菌都有產(chǎn)纖維素酶的能力，在同一培養(yǎng)時間內(nèi)YZ3.23菌株產(chǎn)纖維素酶活性最大，YZ3.41菌株次之，YZ3.66菌株和YZ3.57菌株產(chǎn)纖維素酶活性接近并且最小。培養(yǎng)7天后，這4株真菌產(chǎn)纖維素酶活性分別為:YZ3.23=8.54IU/ml，YZ3.41= 4.59IU/ml， YZ3.66=3.54IU/ml， YZ3.57=3.52IU/ml。

［1］李鐵建．不同蒸制時間制首烏對瀉下作用的影響［D］．延邊:延邊大學(xué)，2007，5－6．

［3］ Zhang Ning．The screening of the Chitinase and Cellulase creation fungi and investigation of the activity of both the enyzymes［D］．長春:Ji Ling University，2007，17－20．

［4］ Lu Jiahua．Cellulase Enzymatic Treatment on Ceulosic Fiber［D］．shanghai:Dong Huay University，2003，28 －29．

［5］ Zhu Junjun．Immobilization ofβ －glucosidase and its improvement in cellulose enzymatic hydrolysis［D］．Nanjing:Nanjing Forestry University，2006，17－18．

［6］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典2010版 (一部) ［M］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄130．