Bmi－1和EZH2基因在皮膚血管瘤組織中的表達(dá)及意義

劉 涓 王 赟 張端蓮

（1武漢大學(xué)人民醫(yī)院老年病科，武漢 430060；2中國(guó)人民解放軍95825部隊(duì)醫(yī)院 湖北432111；3武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，武漢430071）

皮膚血管瘤是嬰幼兒時(shí)期常見的一種良性腫瘤，其發(fā)生率約為1%－12%不等［1－2］。雖然皮膚血管瘤是一種良性腫瘤，但其病理變化主要是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖，因此有部分皮膚血管瘤生長(zhǎng)迅速，可引起容貌缺陷和局部畸形，往往給患者及其家人帶來(lái)極大痛苦，但關(guān)于血管瘤的發(fā)病機(jī)制，目前還沒有明確的說(shuō)法，因此對(duì)于皮膚血管瘤的臨床治療也是目前急待解決的關(guān)鍵問題。

多梳基因家族（PcG）具有高度保守性，除能抑制其下游靶基因轉(zhuǎn)錄外［3］，還能調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新，參與細(xì)胞分化，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生及干細(xì)胞維持中發(fā)揮重要作用［4－6］。Bmi－1、EZH2 同 屬 于PcG家族，并在PcG家族中起核心作用。

本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測(cè)了血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中Bmi－1和EZH2的表達(dá)水平，探討B(tài)mi－1和EZH2在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為臨床上治療血管瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.材料

1.1 材料來(lái)源

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2008年－2011年皮膚毛細(xì)血管瘤存檔蠟塊40例，其中男性15例，女性25例。這些血管瘤所在的部位有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等?；颊咝g(shù)前均未做任何輔助性治療。

1.2 材料分組

將所有標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)S－P法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組：石蠟標(biāo)本中增生期血管瘤22例，退化期血管瘤18例。另取距瘤組織5cm外的周圍正常皮膚組織5例作對(duì)照。

1.3 主要試劑

即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體、鼠抗人Bmi－1和EZH2單克隆抗體（購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（購(gòu)于福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

2方法

2.1 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Bmi－1、EZH2和PCNA相關(guān)抗原

具體步驟：（1）4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水；（2）抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法）；（3）滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；（5）分別滴加一抗（PCNA：1：100；Bmi－1：1：200；EZH2：1：150）；（6）滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育；（7）滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色；（8）蘇木素復(fù)染；（9）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；（10）用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，購(gòu)買的陽(yáng)性片作為Bmi－1和EZH2的陽(yáng)性對(duì)照組，人正常皮膚表皮作為PCNA的陽(yáng)性對(duì)照組。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

（1）Bmi－1和EZH2都是以細(xì)胞核或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，PCNA以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)Bmi－1和EZH2的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。（陽(yáng)性面積率＝單位面積中陽(yáng)性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS11.5軟件對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.PCNA的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核肥大，核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達(dá)強(qiáng)（圖1）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核扁平，胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒，PCNA表達(dá)弱（圖2）。

2.Bmi－1的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒，Bmi－1呈高表達(dá)（圖3）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，Bmi－1呈低表達(dá)（圖4）；正常皮膚組織內(nèi)皮細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，Bmi－1呈低表達(dá)（圖5）。圖像分析結(jié)果見表1。增生期組Bmi－1的表達(dá)明顯高于退化期組和正常皮膚組織組（P＜0.05），而后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

圖1 增生期血管瘤PCNA的表達(dá) 增生的內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒（→），PCNA表達(dá)強(qiáng)，S－P×400Fig.1 PCNA expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in the nucleus of proliferating endothelial cells，which showed PCNA expressed strongly（→）.S－P×400

圖2 退化期血管瘤PCNA的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），PCNA表達(dá)弱，S－P×400Fig.2 PCNA expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in the nucleus of less endothelial cells，which showed PCNA expressed weakly（→）.S－P×400

圖3 增生期血管瘤Bmi－1的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），Bmi－1表達(dá)強(qiáng)，S－P×400Fig.3 Bmi－1expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of proliferating endothelial cells，Bmi－1expressed strongly（→）.S－P×400

圖4 退化期血管瘤Bmi－1的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），Bmi－1表達(dá)弱，S－P×400Fig.4 Bmi－1expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，Bmi－1expressed weakly（→）.S－P×400

圖5 正常對(duì)照組Bmi－1的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），Bmi－1表達(dá)弱，S－P×400Fig.5 Bmi－1expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，Bmi－1expressed weakly（→）.S－P×400

圖6 增生期血管瘤EZH2的表達(dá) 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），EZH2表達(dá)強(qiáng)，S－P×400Fig.6 EZH2expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，EZH2expressed strongly（→）.S－P×400

圖7 退化期血管瘤EZH2的表達(dá)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達(dá)弱或無(wú)表達(dá)（→），S－P×400Fig.7 EZH2expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，EZH2expressed weakly（→）.S－P×400

圖8 正常組EZH2的表達(dá) 血管內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達(dá)弱或無(wú)表達(dá)（→），S－P×400Fig.8 EZH2expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，EZH2expressed weakly（→）.S－P×400

表1 血管瘤不同時(shí)期Bmi－1表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（xˉ±s）Table1 The average optical density and the rate of Bmi－1positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（xˉ±s）

3.EZH2的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒，EZH2表達(dá)強(qiáng)（圖6）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達(dá)弱（圖7）；正常皮膚組織內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，EZH2表達(dá)弱（圖8）。圖像分析結(jié)果見表2。增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞EZH2的表達(dá)顯著低于退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞和正常組織 （P＜0.05），而后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 血管瘤不同時(shí)期EZH2表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（±s）Table2 The average optical density and the rate of EZH2positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（±s）

表2 血管瘤不同時(shí)期EZH2表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（±s）Table2 The average optical density and the rate of EZH2positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（±s）

＊增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期組與正常皮膚組比較，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常皮膚組與增生期組比較，P＜0.05（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

組別Group例數(shù)N平均光密度Average Optical Density陽(yáng)性面積率Rate of Positive Area增生期組Proliferating Group 22 0.2543±0.0157＊ 0.2993±0.0186＊退化期組Involuting Group 18 0.1547±0.0127△ 0.1549±0.0169△正常皮膚組 Normal Skin Group 5 0.1287±0.0116▲ 0.1383±0.0155▲

討 論

血管瘤的自然病程包括增生期、退化期和退化完成期三個(gè)階段。目前血管瘤的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚［7－9］，盡管多數(shù)血管瘤本身不會(huì)危及生命，且可能隨著年齡增長(zhǎng)有消退趨勢(shì)，然而由于血管瘤的生長(zhǎng)往往不同于一般良性腫瘤，在早期特別是在1歲以內(nèi)具有生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)，部分血管瘤可向周圍組織呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，而且它的發(fā)病部位大多位于頭面部體表部位［3］，所以它不僅僅可引起容貌缺陷和局部畸形，還往往給患者及其家人帶來(lái)極大的精神壓力和心理負(fù)擔(dān)，此外還有少部分血管瘤因潰爛、感染、出血、阻塞或壓迫重要組織器官而加重?fù)p傷，甚至可能發(fā)生嚴(yán)重的危及生命的并發(fā)癥。目前關(guān)于治療血管瘤方法的成效并不十分顯著，一些治療模式的顯著副作用也限制了其應(yīng)用。因此探討皮膚血管瘤的發(fā)病機(jī)制對(duì)臨床上治療血管瘤有著重要的意義。

原癌基因 Bmi－1（B－cell specificMo loney murineleukem ia virus insertion site 1）它屬于polycomb家族，直接參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的調(diào)節(jié)［10］。研究證實(shí)人類多種腫瘤，如白血病、乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌及食管癌等的發(fā)生、發(fā)展過程均與 Bmi－1基因表達(dá)異常有關(guān)［11－13］。

在生物體生長(zhǎng)發(fā)育過程中，PcG蛋白是基因調(diào)控決定細(xì)胞命運(yùn)的組成部分，通過形成巨大的多目標(biāo)復(fù)合物，作用在染色體上的不同位點(diǎn)，致使染色體變構(gòu)，從而調(diào)控基因的表達(dá)［14］。PcG蛋白的主要作用目標(biāo)是Homeotic基因簇，hox基因在決定細(xì)胞的定向分化與增殖，以及調(diào)控機(jī)體組織器官的發(fā)育方面起決定性作用。因此，PcG基因，如Bmi－1、Pc2、Cbx7、EZH2的失調(diào)與癌細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)［15］，其中的Bmi－1基因與EZH2一起通過形成多蛋白復(fù)合體維持hox的抑制狀態(tài)。

Breuer等在研究支氣管鱗癌及癌前病變中Bmi－1表達(dá)的相關(guān)機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，癌前病變及癌組織中的Bmi－1表達(dá)明顯高于正常組織，同時(shí)伴有P16的低表達(dá)EZH2表達(dá)增強(qiáng)，推測(cè)EZH2可能為Bmi－1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要中介產(chǎn)物［16］。

本研究結(jié)果顯示：在增生期血管瘤組織中Bmi－1、EZH2蛋白表達(dá)明顯高于正常組織，提示Bmi－1、EZH2基因可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期參與了血管瘤的增生過程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Bmi－1與EZH2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，提示Bmi－1和EZH2蛋白可能共同促進(jìn)了血管瘤的發(fā)生和發(fā)展，推測(cè)其機(jī)制可能是兩者都抑制HOX基因的轉(zhuǎn)錄，通過調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞分裂、阻止細(xì)胞凋亡等來(lái)共同促進(jìn)血管瘤的發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探討。

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