經(jīng)典堿裂解法質(zhì)粒大量提取方法的改良

孟宇，李靜，孫智峰，李玉恒，李昌盛，林增，李士澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染等特定實(shí)驗(yàn)需要高濃度及高純度的質(zhì)粒DNA，且要求DNA的A260/A280值應(yīng)控制在1.8～2.0之間。雖然近些年來質(zhì)粒大量提取試劑盒層出不窮，但大多費(fèi)用較高，所以目前大多實(shí)驗(yàn)室仍以傳統(tǒng)的手提方法為主，其中以薩姆布魯克[1]提出的經(jīng)典堿裂解法應(yīng)用的最為廣泛。但此方法卻仍存在諸多弊端，例如操作復(fù)雜、耗時(shí)、所得質(zhì)粒純度低等，尤其是多次使用有機(jī)溶劑容易造成質(zhì)粒DNA的污染，且易對(duì)實(shí)驗(yàn)人員構(gòu)成危害，實(shí)驗(yàn)廢液也會(huì)造成不同程度的環(huán)境污染[2]。因此本實(shí)驗(yàn)室在經(jīng)典的堿裂解法基礎(chǔ)上，采用物理方法替代化學(xué)方法去除蛋白質(zhì)，從而避免了酚、氯仿等有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者的危害和對(duì)環(huán)境的污染，并且對(duì)改良前后的堿裂解法及試劑盒法所制備的質(zhì)粒DNA的效果進(jìn)行比較。

1 材料和方法

1.1 菌株

大腸桿菌DH5α。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑: 溶液Ⅰ：10 mmol·L-1Tris-HCl，pH7.5，50 mmol·L-1EDTA，pH8.0；滅菌后，4 ℃保存。溶液Ⅱ:1%SDS，0.2 mol·L-1NaOH；現(xiàn)配現(xiàn)用，2%SDS，0.4 mol·L-1NaOH母液等體積混均即可。溶液Ⅲ 1.32 mol·L-1醋酸鉀，pH 4.8，用醋酸調(diào)節(jié)pH值。滅菌后，4℃保存。STE溶液。含RNaseA 20 μg·mL-1的TE溶液。瓊脂糖。質(zhì)粒大量提取試劑盒。

主要儀器：0.2 μm濾膜，電泳儀DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，核酸蛋白定量?jī)x，Gel Doc 2000紫外凝膠成像儀系統(tǒng)，DK-S12電熱恒溫水浴鍋。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)粒DNA的提取與純化

大提試劑盒法:依照試劑盒說明書的步驟提取質(zhì)粒DNA。

經(jīng)典堿裂解法:提取方法主要按文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。

改良的堿裂解法:（1）挑取單菌落于含Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃120 rpm搖菌過夜，至OD值為0.6，取50 mL菌液在冰上預(yù)冷10 min，5000 rpm離心10 min，盡量吸除上清；（2）重復(fù)步驟（1）；（3）將所得菌體沉淀用20 mL冰預(yù)冷的STE洗滌一次，5000 rpm 離心 10 min，吸除上清；（4）向留有菌體沉淀的離心管中加入冰預(yù)冷的Ⅰ溶液2 mL，振蕩懸浮菌體；（5）向離心管中加入4 mL溶液Ⅱ（此過程要在冰上進(jìn)行[3]），溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次使菌體充分裂解，冰預(yù)冷3 min；（6）向離心管中加入4 mL溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，5000 rpm離心10 min，吸取上清轉(zhuǎn)至10 mL新離心管中，5000 rpm離心10 min；（7）用注射器吸取上清，0.22 μm 微孔濾膜過濾；（8）向所得濾液中加入0.7倍體積的異丙醇，輕輕顛倒振蕩，置于-20 ℃ 10 min；（9）5000 rpm 離心 20 min，吸除上清，向離心管中加入70%的乙醇洗滌沉淀；（10）5000 rpm離心3 min，將離心管敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將離心管中殘留的乙醇去除，避免殘留的乙醇影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，例如酶切、PCR等；（11）向離心管中加入200 uL含RNaseA20 μg·m L-1TE溶液溶解沉淀，37℃水浴10 min；（12）取相同的菌液，在相同的條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.3.2 質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

采用瓊脂糖凝膠電泳法:制備1%瓊脂糖凝膠，將三種方法所提的質(zhì)粒DNA，各取3 μL進(jìn)行凝膠電泳，比較三種方法提取質(zhì)粒DNA的效果。

1.3.3 測(cè)定質(zhì)粒DNA的A260/A280值

將三種方法提取的質(zhì)粒各取1 uL并稀釋100倍，經(jīng)核酸蛋白定量測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒DNA的A260/A280值和質(zhì)粒DNA濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖1為質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果：1為經(jīng)典堿裂解法所提質(zhì)粒，較清晰，但仍殘留較多雜質(zhì)；2為試劑盒所提質(zhì)粒，非常清晰，基本無雜質(zhì)；3為改良后的堿裂解法所提質(zhì)粒，非常清晰，基本無雜質(zhì)。

圖1 三種方法提取質(zhì)粒DNA的效果M:marker；1:經(jīng)典堿裂解法提取的質(zhì)粒；2:試劑盒法提取的質(zhì)粒；3:改良后堿裂解法提取的質(zhì)粒Fig.1 Agarose gel electrophoresis of plasmid DNA prepared with three different methodsM:DL 2000 marker；1:plasmid DNA prepared with traditional alkali lysis method；2:plasmid DNA prepared with reagent kit method；3:plasmid DNA prepared with modified method

2.2 三種方法提取質(zhì)粒DNA的A260/A280值和濃度

表1為三種方法提取的質(zhì)粒DNA濃度的比較，從表中可看出：改良后的堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA濃度明顯高于經(jīng)典堿裂解法及試劑盒法。表2為三種方法提取質(zhì)粒DNA的A260/A280值的比較，從表中可看出：改良后的堿裂解法所提取的質(zhì)粒DNA純度均在1.8～2.0之間，明顯比經(jīng)典堿裂解法效果好，而與試劑盒法相差無幾，符合細(xì)胞轉(zhuǎn)染等特定實(shí)驗(yàn)的使用要求。

表1 三種方法提取質(zhì)粒DNA的濃度Table 1 The DNA density of three method extraction material particle DNA density

表2 三種方法提取質(zhì)粒DNA的A260/A280值Table 2 The DNA A260/A280 value of three method extraction material particle

3 討論

實(shí)驗(yàn)在經(jīng)典堿裂解法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，用其他方法[4-9]提取多數(shù)都需要較長(zhǎng)時(shí)間，而改良后的操作方法可節(jié)省時(shí)間，最重要的是以物理方法替代用有機(jī)溶劑抽提除蛋白質(zhì)的化學(xué)方法。利用濾膜將蛋白質(zhì)完全去除，同時(shí)用異丙醇除去小片段DNA[10]，最后用RNaseA將RNA消化掉，避免了酚、氯仿等對(duì)質(zhì)粒DNA的污染，同時(shí)保障了實(shí)驗(yàn)者的安全。而且改良后的堿裂解法提取出的質(zhì)粒DNA的濃度，明顯高于試劑盒法及經(jīng)典堿裂解法，其純度更是可以與試劑盒法相媲美，并且所需費(fèi)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于試劑盒的價(jià)格。此方法操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短，摒除了酚、氯仿的使用，減少對(duì)環(huán)境的污染，綠色環(huán)保。更降低了實(shí)驗(yàn)成本，節(jié)省資源，可以在實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用，利于實(shí)驗(yàn)研究。

在操作過程中需要注意一些問題:（1）操作過程要認(rèn)真細(xì)致，避免細(xì)菌及其他物質(zhì)的污染；（2）過濾之前吸出的離心上清液要盡量減少蛋白質(zhì)的含量，過濾時(shí)速度緩慢，防止濾液經(jīng)濾膜邊緣流過而污染過濾完的濾液；（3）根據(jù)實(shí)際情況加入足量的RNaseA，并且孵育時(shí)間充足，以防RNA消化不完全，對(duì)結(jié)果造成影響；（4）提出的質(zhì)粒DNA濃度與所提菌液的新鮮度及菌液中細(xì)菌的密度有很大關(guān)系，應(yīng)注意；（5）溶液Ⅱ現(xiàn)用現(xiàn)配，加入溶液Ⅱ后混勻一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮黏稠[11]，作用時(shí)間不要超過5 min，以免質(zhì)粒受到破壞；（6）加入溶液Ⅲ后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀，如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

［1］薩姆布魯克，D W拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京：科學(xué)出版社，2005.

［2］鄧云華，唐庭煉，金愛銀，等.一起城市自來水酚污染事件的調(diào)查［J］.環(huán)境與健康雜志，2002（3）：63.

［3］Isidoro Felieiello，Ganni Chinali.A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from E.coli［J］.Analytical Biochemistry，1993，212：394-401.

［4］陳紹興，李沁，董艷，等.質(zhì)粒DNA提取的簡(jiǎn)便方法［J］.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）：8-9.

［5］代敏，王雄清，彭成，等.乳牛乳腺炎病原菌的質(zhì)粒提取及其四環(huán)素耐藥基因的擴(kuò)增［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009（4）：87-92.

［6］王錦文，李均敏，丁麗亞，等.丙烯酞胺降解細(xì)菌質(zhì)粒抽提方法的比較［J］.臺(tái)州學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，25（3）：58-61.

［7］周鶴峰，邵敏，葛正龍.堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的研究［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，28（3）：225-227.

［8］姚偉，周會(huì)，徐景升，等.質(zhì)粒DNA小量提取法的改進(jìn)［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2005，11（6）：776-777.

［9］倪志華，趙曉瑜.堿裂解提取質(zhì)粒DNA的改進(jìn)方法［J］.河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，25（2）：321-322.

［10］R Lakshmi，V Baskar，U Ranga.Extraction of superior quality Plasmid DNA by a combination of modified alkaline lysis and Silica matrix ［J］.Anal Biochem，1999，272（1）：109-112.

［11］S Ehrt.D Schnapp inger.lsolation of plasmids from Ecoli by alkaline lysis ［J］.Methods Mol Biol，2003，235：75-78.