呼和浩特地區(qū)奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及其致病性與藥敏試驗(yàn)

巴開(kāi)明 李曉艷 內(nèi)蒙古呼和浩特市動(dòng)物疫病防控中心 010020

奶牛乳房炎是困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)的四大疾病之一，由于飼養(yǎng)環(huán)境和管理水平的不同，導(dǎo)致其病原菌的多樣性和地區(qū)性差異。2011年7月至8月間，我們對(duì)呼市地區(qū)部分奶牛場(chǎng)乳樣的病原菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其致病性和藥物敏感性進(jìn)行研究，以期對(duì)臨床合理治療乳房炎提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）待檢材料

待檢乳樣主要采自呼和浩特市地區(qū)3個(gè)旗（縣、區(qū)）的5個(gè)大中型奶牛場(chǎng)（養(yǎng)殖小區(qū)），每個(gè)奶牛場(chǎng)每次隨機(jī)采取為無(wú)臨床癥狀或癥狀不明顯的10-15頭奶牛乳汁，共采集64頭奶牛256份乳樣。

（2）培養(yǎng)基

普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮羊血瓊脂培養(yǎng)基和血清肉湯培養(yǎng)基，按參考文獻(xiàn)[1]介紹的方法自行配制；麥康凱瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：201001123），按產(chǎn)品說(shuō)明介紹方法進(jìn)行配制；各種微量生化培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：100223）。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）采樣方法

先用溫水，再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳頭。采樣者同時(shí)進(jìn)行手指擦拭消毒。每個(gè)乳室先擠去頭2～3把奶，以排除污染的雜菌，每頭奶牛取乳樣5～10mL.置于無(wú)菌試管中。采樣后立即送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

（2）病原菌的分離培養(yǎng)

（A）細(xì)菌分離培養(yǎng)

將新鮮采集的乳樣搖勻，分別取適量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯（10%血清）、普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（平板）后，置于37℃溫箱培養(yǎng)24～48h。觀察每個(gè)平板中細(xì)菌生長(zhǎng)的情況，對(duì)菌落進(jìn)行涂片染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)特征和染色特性，挑取單個(gè)可疑菌落分別接種相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行純分離。

（B）生化鑒定

將上述純分離的細(xì)菌分別進(jìn)行涂片染色鏡檢，檢驗(yàn)其純度，然后將純分離的細(xì)菌根據(jù)其疑似特征分別進(jìn)行糖類分解試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)M.R和V-P試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)、CAMP試驗(yàn)、馬尿酸鹽水解試驗(yàn)、吲哚(靛基質(zhì)）試驗(yàn)進(jìn)行生化鑒定。

（C）動(dòng)物致病性試驗(yàn)

取不同地區(qū)分離到主要細(xì)菌金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌、變形桿菌各5株，用細(xì)菌的37℃、24h肉湯培養(yǎng)物，分別進(jìn)行小白鼠腹腔注射，劑量為0.2mL/只的每種細(xì)菌注射4只，同時(shí)用生理鹽水對(duì)照。觀察24h內(nèi)的發(fā)病死亡情況，對(duì)死亡或發(fā)病明顯者立即進(jìn)行剖檢，取發(fā)病小白鼠的心、肝組織涂片、鏡檢，若與注入細(xì)菌相同，則判定此菌為病原菌。未死亡的繼續(xù)觀察1周后剖解，觀察其變化。

（D）藥物敏感性試驗(yàn)

[2]介紹的圓紙片擴(kuò)散法進(jìn)行，即用吸管滴加純培養(yǎng)菌液0.1-0.2mL于鮮血瓊脂平板上，用L棒將菌液均勻涂布，加蓋后放置10min左右，待平板面稍干，用鑷子將藥敏紙片平放在瓊脂平板上，并輕壓使其緊貼平板表面，藥敏紙片一旦接觸平板即不再移動(dòng)。用直徑為90mm的平皿，可貼紙片5張，兩紙片中心距離不少于24mm，紙片與平皿邊緣不少于15mm。貼好紙片的平板，置37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑(包括藥敏紙片直徑)，計(jì)算同一類菌不同菌株的平均抑菌直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑在20mm以上為極敏感，直徑在15-20mm為高度敏感，直徑10-15mm為中度敏感，直徑在10mm以下為低度敏感，無(wú)抑菌圈為不敏感。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離結(jié)果

對(duì)64頭奶牛的256份乳樣隨機(jī)取樣64份進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，從61份乳樣中檢出10種菌共98株，陽(yáng)性率是 95.31%（61/64）。24份隱性乳房炎乳樣中24份陽(yáng)性，陽(yáng)性率100%（24/24），混合感染型14份，混合感染率是58.33%；8份臨床型乳腺炎乳樣中8份陽(yáng)性，陽(yáng)性率100%，混合感染型4份，混合感染率是50.00%。64份乳樣中混合感染率共占28.13%（18/64），混合感染菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌、鏈球菌，其中混合感染中優(yōu)勢(shì)菌株是大腸桿菌。隱性乳房炎的主要病原菌是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌，臨床型乳房炎的主要病原菌是停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、變性桿菌。各地檢出菌結(jié)果見(jiàn)表1。

表1：各旗(縣、區(qū))檢出細(xì)菌結(jié)果 單位:株

2.2 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

注射5株金黃色葡萄球菌的小白鼠有10只死亡，并從死亡小白鼠肝臟中分離到金黃色葡萄球菌，其余沒(méi)有死亡小白鼠有不同程度的臨床反應(yīng)，例如，精神沉郁、采食量下降、被毛蓬亂等。注射鏈球菌的小白鼠組未出現(xiàn)死亡，可見(jiàn)小白鼠精神沉郁、畏寒、被毛蓬亂、飲食減少或停止，2天后恢復(fù)正常，第3天處死解剖見(jiàn)腹腔內(nèi)有大小不等的膿包，并從膿包中均分離到了鏈球菌。注射大腸桿菌組小白鼠有4只死亡，其余均有不同程度的臨床反應(yīng)。注射克雷伯氏菌組的小白鼠未出現(xiàn)死亡，只有不同程度的臨床反應(yīng)。而注射變形桿菌組的小白鼠只出現(xiàn)了比較輕微的臨床反應(yīng)，很快就恢復(fù)正常。

2.3 部分分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)分離的5種15株細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2：部分分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 單位：mm

由表2可以看出，臨床上常用的20種抗菌藥物，不同養(yǎng)殖場(chǎng)分離的細(xì)菌對(duì)20種藥物的敏感性差異極大，有的場(chǎng)對(duì)大部分藥物都敏感，而有的場(chǎng)只對(duì)部分藥物敏感，而從兩個(gè)不同場(chǎng)分離的克雷伯氏菌對(duì)20種藥物均高度敏感。不同致病菌對(duì)不同抗菌藥產(chǎn)生了不同程度耐藥性，其他所有致病菌對(duì)青霉素均耐藥。結(jié)果提示，治療奶牛乳房炎最好的辦法是各地找準(zhǔn)主要致病菌，通過(guò)藥敏試驗(yàn)找出敏感藥物治療乳房炎，避免濫用抗菌藥，提高乳房炎的治愈效果。

3 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)從64頭奶牛的256份乳樣隨機(jī)取樣64份進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，從61份乳樣中檢出10種菌共98株，陽(yáng)性率是 95.31%（61/64）。說(shuō)明各奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)在夏季細(xì)菌感染是造成奶牛乳房炎的主要因素。分析其原因，可能與呼和浩特地區(qū)夏季氣溫比較高且多雨，各種致病菌大量滋生，再加上各場(chǎng)對(duì)消毒措施不夠嚴(yán)格有著密切的關(guān)系。另外，雖然細(xì)菌分離率比較高，但不是能分離到細(xì)菌就一定是乳房炎的患牛，有些正常牛也可在其乳中分離到細(xì)菌的。同時(shí)，乳中細(xì)菌分離率比較高也說(shuō)明這些養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中細(xì)菌污染比較嚴(yán)重。

一般認(rèn)為，引起奶牛乳房炎的細(xì)菌主要為金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌等，而本次試驗(yàn)中在一個(gè)地區(qū)的兩個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)分離到了3株沙門(mén)氏菌，而且均是混合感染有其它致病菌，結(jié)果表明，在一些地區(qū)沙門(mén)氏菌也是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，在防治中也應(yīng)給以高度重視。從我們對(duì)呼和浩特地區(qū)奶牛乳房炎患牛細(xì)菌分離結(jié)果來(lái)看，引起本地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌為停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌等。這與其他類似研究所報(bào)道的結(jié)果是一致的。

從動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果中可看出，雖然多數(shù)細(xì)菌可引起小白鼠的臨床反應(yīng)，但致死率比較低，說(shuō)明多數(shù)引起奶牛乳房炎的病原菌的致病力不強(qiáng)，但這些細(xì)菌在乳房?jī)?nèi)繁殖和產(chǎn)生的毒素、代謝產(chǎn)物等可造成乳房出現(xiàn)炎癥。

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各養(yǎng)殖場(chǎng)分離菌對(duì)試驗(yàn)中所使用的20種抗菌藥物的敏感性差異極大，有些場(chǎng)的分離的菌對(duì)試驗(yàn)中絕大多數(shù)藥物敏感，而有的養(yǎng)殖場(chǎng)的分離菌只對(duì)極少數(shù)藥物敏感，這可能是這些養(yǎng)殖場(chǎng)的奶牛多是從不同地區(qū)的散戶收購(gòu)來(lái)的，散戶自己在平時(shí)的治療中使用過(guò)多種抗生素，使細(xì)菌產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)、生理及生化功能的改變，它們對(duì)各種藥物的敏感性降低或消失，因此產(chǎn)生了耐藥性。而養(yǎng)殖場(chǎng)的奶牛在集中飼養(yǎng)后，由于不注意消毒，造成了奶牛的交叉感染，使得在發(fā)病后的治療中效果不理想。所以在藥物的選擇上，建議各養(yǎng)殖場(chǎng)在治療時(shí)最好選用兩種或兩種以上的敏感藥物交替使用，以防止抗藥菌的產(chǎn)生。從我們對(duì)不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)的部分分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果可看出，這些分離菌對(duì)頭孢噻吩、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、恩諾沙星高度敏感。因此，建議呼和浩特地區(qū)各養(yǎng)殖場(chǎng)在今后的奶牛乳房炎防治中可采用上述敏感藥物進(jìn)行治療。對(duì)那些產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥性的養(yǎng)殖場(chǎng)治療時(shí)最好對(duì)發(fā)病奶牛進(jìn)行病原分離，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)本場(chǎng)的病原種類和耐藥性情況，這樣治療效果才會(huì)比較理想。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳天壽主編，微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1993

[2]鄧旭明.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001