液相色譜法測(cè)定檳榔飲片中檳榔堿含量的不確定度評(píng)定*

趙振東，周雪晴，劉艷鳳，馮玉紅

(海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，?？?570228)

液相色譜法測(cè)定檳榔飲片中檳榔堿含量的不確定度評(píng)定*

趙振東，周雪晴，劉艷鳳，馮玉紅

(海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，?？?570228)

根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》對(duì)液相色譜法測(cè)定檳榔飲片中檳榔堿含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定。通過(guò)分析得出，體積類(lèi)不確定度是主要影響因素。分析結(jié)果表明，當(dāng)檳榔飲片中檳榔堿含量為0.58%時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.02%（k=2）。

液相色譜法；檳榔；檳榔堿；不確定度

檳榔是棕櫚科植物檳榔(Areca Catechu L.)的成熟種子，其性味溫辛、無(wú)毒，有殺蟲(chóng)、破積、下氣、行水等多種功效，對(duì)蟲(chóng)積、食滯、瀉痢嚴(yán)重、水腫及腳氣等癥均有較好的治療效果。檳榔中含生物堿0.3%～0.6%，其中檳榔堿為主要有效成分［1］。

筆者根據(jù)國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的JJF1059–1999計(jì)量技術(shù)規(guī)范《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，并參照其它文獻(xiàn)，首次對(duì)液相色譜法測(cè)定檳榔中檳榔堿含量的測(cè)量不確定度進(jìn)行了分析，考察了其不確定度的主要來(lái)源，為實(shí)驗(yàn)過(guò)程的控制和檢測(cè)報(bào)告的評(píng)估提供了科學(xué)的依據(jù)［2］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters 2695型，美國(guó)waters公司，經(jīng)華南國(guó)家計(jì)量測(cè)試中心檢定為合格計(jì)量器具；

電子天平：AUW220D（0.1/0.01 mg），日本島津公司，經(jīng)海南省計(jì)量測(cè)試所檢定為①級(jí)合格；

單標(biāo)線容量瓶：10 mL，經(jīng)海南省計(jì)量測(cè)試所檢定為A級(jí)；

可調(diào)移液器：100μL，經(jīng)海南省計(jì)量測(cè)試所檢定；

超純水制備系統(tǒng)：PURELAB ULTRA ANALYTIC型，美國(guó)ELGA公司；

氫溴酸檳榔堿：純度100%，美國(guó)Sigma公司；

乙二胺、磷酸：分析純；

甲醇、乙醇：色譜純，美國(guó)Fisher公司；

超純水：電阻率為18.2 MΩ·cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取氫溴酸檳榔堿對(duì)照品10.01 mg(mR)于10 mL(VR1)量瓶中，加水溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。用可調(diào)移液器量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL(VR2)于10 mL(VR3)量瓶中，加水定容至刻度，此溶液作為檳榔堿對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取檳榔粗粉50.000 4 g（m）于1 L三角瓶中，加氨水8 mL，加乙醚800 mL超聲15 min，傾出乙醚提取液至預(yù)置8 mL磷酸液的蒸發(fā)皿中，再分別加乙醚640，320 mL，超聲2次，每次15 min，合并乙醚提取液，揮去乙醚，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL(VS)容量瓶，并以同一溶劑稀釋至刻度，搖勻，離心（10 000 r/min）10 min，上清液經(jīng)液相色譜測(cè)定［3］。

1.3 色譜條件

色譜柱：C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；流動(dòng)相：0.3%乙二胺溶液(磷酸調(diào)pH 7.5)–甲醇–乙腈（體積比為1∶3∶1），流速為1.0 mL/min［4］。

1.4 測(cè)定和計(jì)算

將對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并計(jì)算檳榔堿含量。對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣3次，平均峰面積AR為334 976；供試品溶液分別進(jìn)樣3次，平均峰面積AS為390 301；按照建立的數(shù)學(xué)模型計(jì)算，檳榔飲片中檳榔堿含量為0.58%。

1.5 數(shù)學(xué)模型和不確定度計(jì)算公式

樣品中檳榔堿含量測(cè)定采用外標(biāo)法，檳榔飲片中檳榔堿含量按式（1）計(jì)算：

式中：w——檳榔飲片中檳榔堿含量，%；

mR——?dú)滗逅釞壚茐A對(duì)照品質(zhì)量，mg；

VS——供試品溶液的定容體積，mL；

VR2——稀釋時(shí)可調(diào)移液器量取的對(duì)照品儲(chǔ)備液的體積，mL；

AS——供試品溶液中檳榔堿的峰面積，μV·s；

P——對(duì)照品的純度，為100%；

m——檳榔粗粉質(zhì)量，mg；

VR1——對(duì)照品儲(chǔ)備液的定容體積，mL；

VR3——對(duì)照品溶液的定容體積，mL；

AR——對(duì)照品溶液中檳榔堿的峰面積，μV·s。

則檳榔飲片中檳榔堿含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（2）計(jì)算：

1.6 不確定度來(lái)源

根據(jù)以上數(shù)學(xué)模型和不確定度計(jì)算公式，可以得出含量測(cè)定結(jié)果(w)的不確定度分量分別來(lái)源于mR，m，VS，VR1，VR2，VR3，AS，AR和P。對(duì)這9個(gè)不確定度來(lái)源，按其性質(zhì)可以分為質(zhì)量類(lèi)不確定度(mR，m)、體積類(lèi)不確定度(VS，VR1，VR2，VR3)、峰面積類(lèi)不確定度(AS，AR)以及對(duì)照品純度類(lèi)不確定度。

2 不確定度評(píng)定［5，6］

2.1 對(duì)照品純度引入的不確定度

氫溴酸檳榔堿購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度100%，分散區(qū)間半峰寬a =0.05%(P=100 %)，按矩形分布計(jì)算，對(duì)照品純度引入的不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 體積類(lèi)不確定度（VS，VR1，VR2，VR3）

2.2.1 供試品溶液的定容體積(VS)引入的不確定度

（1）10 mL單標(biāo)線容量瓶體積校準(zhǔn)引入的不確定度

單標(biāo)線容量瓶體積的校準(zhǔn)不確定度來(lái)源于校準(zhǔn)時(shí)有限的準(zhǔn)確度。單標(biāo)線容量瓶(10 mL)A級(jí)品的法定允差為±0.02 mL，考慮到中心區(qū)的分布幾率大于極值附近，按照三角形分布進(jìn)行計(jì)算，不確定度為0.02 mL/60.5=0.008 2 mL。

（2）溫度引入的不確定度

該項(xiàng)不確定度來(lái)源于校準(zhǔn)溫度不同時(shí)引入的體積差別。實(shí)驗(yàn)室的溫度在19～25℃之間，最大溫差為6℃，水溶液的體積膨脹系數(shù)約為2.1×10–4/℃，玻璃的體積膨脹系數(shù)約為1.5×10–5/℃，忽略玻璃的體積膨脹系數(shù)，按照矩形分布計(jì)算，10 mL單標(biāo)線容量瓶的不確定度為：

（3）單標(biāo)線容量瓶體積重復(fù)性引入的不確定度

該不確定度來(lái)源于連續(xù)核查排出的滿刻度體積液體的標(biāo)準(zhǔn)偏差，為A類(lèi)不確定度，通常用稱(chēng)量法確定。對(duì)一單標(biāo)線容量瓶（10 mL）A級(jí)品的重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估，稱(chēng)得液體質(zhì)量分別為9.901，9.905，9.902，9.903，9.905，9.902，9.897，9.901，9.912，9.909 g，按照Bessel公式，計(jì)算得到體積重復(fù)性不確定度為0.001 4 mL。

則供試品溶液的定容體積(VS1)引入的不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的定容體積(VR1)引入的不確定度

由于用單標(biāo)線容量瓶(10 mL)A級(jí)品定容，因此計(jì)算原理及結(jié)果同“2.2.1”部分，即：

2.2.3 稀釋時(shí)可調(diào)移液器量取對(duì)照品儲(chǔ)備液的體積(VR2)引入的不確定度

計(jì)算原理同“2.2.1”部分。

(1)可調(diào)移液器量取體積校準(zhǔn)引入的不確定度

移液器(0.1 mL)法定允差為±0.002 mL，按照三角形分布進(jìn)行計(jì)算，不確定度為:

(2)溫度引入的不確定度

按照矩形分布計(jì)算，移液器(0.1 mL)的不確定度為：

(3)可調(diào)移液器體積重復(fù)性引入的不確定度

對(duì)移液器(1 mL)的重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估，稱(chēng)得液體重量（g）分別為0.100 4，0.100 7，0.101 1，0.100 5，0.100 7，0.100 5，0.100 3，0.101 4，0.100 6，0.1050 7，按照Bessel公式，計(jì)算得到體積重復(fù)性不確定度為0.000 007 mL。

合成以上不確定度，對(duì)照品儲(chǔ)備液的體積(VR2)引入的不確定度為：

則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 對(duì)照品溶液的定容體積(VR3)不確定度

由于用單標(biāo)線容量瓶(10 mL)A級(jí)品定容，計(jì)算原理及結(jié)果同“2.2.1”部分，即:

2.3 質(zhì)量類(lèi)不確定度（mR，m）

2.3.1 氫溴酸檳榔堿對(duì)照品質(zhì)量（mR）引入的不確定度

（1）天平校準(zhǔn)引入的不確定度

使用的電子天平(d=0.01 mg)為一級(jí)工作天平，檢定證書(shū)給出最大允差為±0.15 mg，按照三角形分布進(jìn)行計(jì)算，不確定度為：

（2）稱(chēng)量重復(fù)性引入的不確定度

該項(xiàng)不確定度來(lái)源于同一物體稱(chēng)量時(shí)讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，為A類(lèi)不確定度。對(duì)氫溴酸檳榔堿重復(fù)稱(chēng)量10次，讀數(shù)分別為10.05，10.06，10.10，10.08，10.05，10.10 ，10.11，10.07，10.04，10.07 mg，根據(jù)Bessel公式計(jì)算得到質(zhì)量重復(fù)性引入的不確定度為0.007 6 mg。

2.3.2 檳榔粗粉質(zhì)量（m）引入的不確定度

（1）天平校準(zhǔn)引入的不確定度

使用天平同“2.3.1”部分，不確定度為：

(2)稱(chēng)量重復(fù)性引入的不確定度

來(lái)源于同一物體稱(chēng)量時(shí)讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，為A類(lèi)不確定度。對(duì)檳榔粗粉重復(fù)稱(chēng)量10次，讀數(shù)分別為50.001 5，50.001 7，50.001 2，50.001 7，50.001 1，50.001 1，50.001 6，50.001 1，50.001 3，50.001 1 g，根據(jù)Bessel公式計(jì)算得到重量重復(fù)性不確定度為0.082 mg。

2.4 峰面積類(lèi)不確定度（AS，AR）

2.4.1 峰而積(AS)重復(fù)性引入的不確定度

該不確定度來(lái)源于重復(fù)進(jìn)樣時(shí)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差,為A類(lèi)不確定度。在本實(shí)驗(yàn)中，重復(fù)進(jìn)樣3次，峰面積為390 322，390 260，390 321，平均峰面積為390 301。按照Bessel公式，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4.2 峰而積(AR)重復(fù)性引入的不確定度

來(lái)源于重復(fù)進(jìn)樣時(shí)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差為A類(lèi)不確定度。在本實(shí)驗(yàn)中，重復(fù)進(jìn)樣3次，峰面積為334 983，334 965，334 979。平均峰面積為334 976。按照Bessel公式，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3 合成不確定度

將以上數(shù)據(jù)代入式（2），得到檳榔飲片中檳榔堿含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4 擴(kuò)展不確定度與測(cè)定結(jié)果表示

檳榔含量測(cè)定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度U=ku(w)，取k=2，則U=2×0.007%≈0.02%。檳榔飲片中檳榔堿含量可表示為0.58%±0.02%，k=2。

5 結(jié)語(yǔ)

對(duì)檳榔飲片中檳榔堿的液相色譜法測(cè)定結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評(píng)定。評(píng)定結(jié)果表明，體積類(lèi)不確定度是主要的不確定來(lái)源；質(zhì)量類(lèi)不確定度和對(duì)照品純度類(lèi)不確定度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大；而峰面積類(lèi)不確定度則幾乎可以忽略不計(jì)。因此，涉及溶液配制過(guò)程是本實(shí)驗(yàn)中影響測(cè)定結(jié)果的主要因素，需重點(diǎn)加以控制。

［1］ 趙振東，謝艷麗，牛成，等.毛細(xì)管電泳法分析檳榔中檳榔堿和檳榔次堿［J］.海南師范學(xué)院學(xué)報(bào),2009，22(2): 170–172.

［2］ 中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委.化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南［M］.北京，中國(guó)計(jì)量出版社，2002.

［3］ 史載鋒，吳亞弟，林小明，等.檳榔堿提取分離工藝的研究［J］.海南師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，19 (3): 246–247.

［4］ 馮玉紅，陳國(guó)良，于文輝，等.現(xiàn)代儀器分析實(shí)用教程［M］.北京：北京大學(xué)出版社，2008: 89–112.

［5］ 金鵬飛，鄒定，姜文清.格列吡嗪片高效液相法含量測(cè)定結(jié)果的不確定度評(píng)定［J］.藥物分析雜志，2008，28(7): 1 136–1 140.

［6］ 張霞，許永，劉巍，等.離子色譜法測(cè)定卷煙主流煙氣中氨含量的不確定度評(píng)定［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2011，20(4): 16–19.

Uncertainty Evaluation for Determining Content of Arecoline in Areca by HPLC

Zhao Zhendong， Zhou Xueqing， Liu Yanfeng， Feng Yuhong
(College of Materials and Chemical Engineering， Hainan University， Haikou 570228， China)

The measurement uncertainty of Arecoline in Areca by HPLC was evaluated according to Evaluation and Presentation of Uncertainty in Measurement. Volume uncertainty was main factor. The Expanded uncertainty was 0.02%(k=2)，as the content of Arecoline in Areca was 0.58%.

HPLC; Areca; Arecoline; uncertainty

O657.7+2

A

1008–6145(2012)03–0007–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.002

* 海南大學(xué)材料與化工學(xué)院青年基金項(xiàng)目(南藥檳榔的開(kāi)發(fā)與利用)

聯(lián)系人：馮玉紅；Email: zhaozhd@gmail.com

2012–02–08