Caspase-3參與白花敗醬草皂苷誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡

張 濤 田黎明 朱貴明 任繼秋 張 宇 田麗華

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

白花敗醬草是敗醬科草本植物的根莖及帶根全草，在中國(guó)的華東、華中、華南及西南各地均有分布，是一種常用植物藥。白花敗醬草具有清熱利濕、解毒排膿、活血化瘀、清心安神、改善肝功能、抑菌和抗病毒等作用。關(guān)于黃花敗醬體內(nèi)抗腫瘤，體外誘導(dǎo)人乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞凋亡的作用曾有報(bào)道〔1〕，但白花敗醬草及其總皂苷在抗腫瘤方面的作用，較少報(bào)道〔2〕。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑 人宮頸癌Hela細(xì)胞株由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物教研室贈(zèng)送;RPMI-1640干粉培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青公司);AB8大孔吸附樹脂購(gòu)于天津南開大學(xué)化工廠。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥材與處理 白花敗醬草購(gòu)于秦皇島市民樂醫(yī)藥公司，由安國(guó)市昌達(dá)中藥材飲片有限公司提供。

1.2.1.1 白花敗醬草水提物的制備〔3〕白花敗醬草粉碎后加適量水，浸泡3 h，煮沸提取60 min，收集藥液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓回收得白花敗醬草水提液，真空干燥箱55℃干燥，得敗醬草水提物固體干粉。

1.2.1.2 白花敗醬草總皂苷的制備 取干燥的白花敗醬草4 kg，粉碎，按1∶10用70%食用酒精浸泡4 h，加熱回流提取2次，合并濾液減壓回收乙醇，得白花敗醬草乙醇粗提物。此粗提物加入石油醚脫脂，用AB8大孔吸附樹脂層析分離總皂苷。白花敗醬草醇提物上層析柱后用蒸餾水洗脫至洗脫液中無(wú)糖為止(Molish反應(yīng)陰性)。再分別用30%、50%和70%乙醇洗脫，收集洗脫液，至各洗脫液Liberman-Burchard反應(yīng)陰性為止。洗脫液減壓回收乙醇，真空干燥得淡黃色粗提物，終重量為25.2 g，白花敗醬草總皂苷的提取率約為0.63%。皂苷鑒定∶取少量干燥提取物，與濃硫酸-醋酐(1∶20)反應(yīng)顯藍(lán)綠色，證明提取物為甾體皂苷〔3〕。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，50 ml/L CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每2～3 d傳代。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制作用 水提物終濃度分別為 0.20，0.40，0.80，1.20 mg/ml;皂苷終濃度分別為0.05，0.10，0.15，0.20 mg/ml。另設(shè)未加藥物只加細(xì)胞的對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，誘導(dǎo)48 h。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%。根據(jù)各組藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，運(yùn)用SPSS10.0軟件計(jì)算出藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3.2 光鏡觀察Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征 皂苷0.15 mg/ml，水提物1.20 mg/ml，陰性對(duì)照組培養(yǎng)48 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，4%多聚甲醛固定，4℃過夜。蘇木素-伊紅(H-E)染色，光鏡觀察拍照。

1.2.3.3 電鏡觀察Hela細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 用皂苷0.15 mg/ml處理Hela細(xì)胞48 h和72 h后，樹脂包埋，烘烤24 h固化成硬塊，切成超薄切片(50 nm)，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色后，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.2.3.4 Hela細(xì)胞Caspase-3活性的檢測(cè) 皂苷終濃度為0.15、0.20 mg/ml，水提物終濃度為 0.80、1.20 mg/ml，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀測(cè)定OD405值，通過計(jì)算OD給藥組/OD陰性對(duì)照的倍數(shù)來確定各組Caspase-3的活化程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS9.13軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間差異的顯著性先方差分析，再采用Dunnet't檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 白花敗醬草皂苷和水提物對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用總皂苷和水提取物的 IC50值分別是 59.2μg/ml和199.9μg/ml。根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥中心(NCI)標(biāo)準(zhǔn):IC50≤230μg/ml可作為抗腫瘤藥物，說明白花敗醬草總皂苷和水提物對(duì)Hela細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。見表1，表2。

2.2 白花敗醬草總皂苷誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

2.2.1 HE染色光鏡觀察結(jié)果 光鏡下可見對(duì)照組的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞質(zhì)多，胞核染色質(zhì)疏松，染色較淡;皂苷0.15 mg/ml及水提物1.20 mg/ml誘導(dǎo) Hela細(xì)胞48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，出現(xiàn)胞體變圓，胞質(zhì)起泡，染色質(zhì)凝集深染等。見圖1。

表1 白花敗醬草總皂苷對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

表2 白花敗醬草水提物對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

圖1 HE染色光鏡觀察結(jié)果(×100)

2.2.2 電鏡觀察結(jié)果 電鏡下可見對(duì)照組Hela細(xì)胞膜表面有較多微絨毛，染色質(zhì)疏松，核仁明顯。皂苷0.15 mg/ml誘導(dǎo)Hela細(xì)胞48 h和72 h后，可見細(xì)胞變小，細(xì)胞膜表面微絨毛消失，出現(xiàn)早期細(xì)胞凋亡的染色體邊集，細(xì)胞質(zhì)中空泡化明顯，可見含致密染色質(zhì)和細(xì)胞膜的凋亡小體。見圖2。

圖2 電鏡觀察Hela細(xì)胞形態(tài)(TME，×6 000)

2.3 敗醬草皂苷和水提物對(duì)Hela細(xì)胞Caspase-3活性的影響用白花敗醬草總皂苷和水提物誘導(dǎo)Hela細(xì)胞48 h后，各誘導(dǎo)組Caspase-3活性比對(duì)照組均有顯著增高，總皂苷0.15 mg/ml和水提物1.2 mg/ml激活Caspase-3活性分別是對(duì)照組的3.70和2.42倍。見表3，表4。

表3 敗醬草總皂苷對(duì)Hela細(xì)胞Caspase-3活性的影響

表4 敗醬草水提物對(duì)Hela細(xì)胞Caspase-3活性的影響

3 討論

有研究表明多種皂苷具有明顯的抗腫瘤活性〔4，5〕，本實(shí)驗(yàn)白花敗醬草總皂苷和水提物對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，表明Hela細(xì)胞對(duì)白花敗醬草皂苷的抑制作用敏感，初步確定皂苷是白花敗醬草有效的抗腫瘤活性成分。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。細(xì)胞凋亡時(shí)具有典型的形態(tài)和生化特征〔6〕。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，并與Caspases家 族 和 Bcl-2家 族 密 切相關(guān)〔7〕。Caspases為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的簡(jiǎn)稱，是一組具有相似氨基酸順序和二級(jí)結(jié)構(gòu)的半胱氨酸蛋白酶，參與細(xì)胞因子成熟、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，還與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)在凋亡通路中處于重要地位，尤其 Caspase-3是其中的中心環(huán)節(jié)，Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，而Caspase-3催化一些底物的降解是導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮的關(guān)鍵步驟〔8〕。本實(shí)驗(yàn)表明白花敗醬草總皂苷通過誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡，達(dá)到其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用;白花敗醬草總皂苷和水提物誘導(dǎo) Hela細(xì)胞凋亡的同時(shí)，各誘導(dǎo)組細(xì)胞中Caspase-3活性也比對(duì)照組明顯增高，說明Caspase-3參與白花敗醬草皂苷誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的作用，有關(guān)白花敗醬草皂苷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是否通過線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，尚待進(jìn)一步研究。

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