高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定盆炎凈片中原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷含量

黎 強(qiáng) ，張曉娟 ，羅 玲

盆炎凈片由忍冬藤、狗脊、蒲公英、益母草、車前草、川芎、赤芍、雞血藤8味中藥組方，具有清熱利濕、利血通絡(luò)、調(diào)經(jīng)止帶功效[1]。方中忍冬藤清熱解毒，疏風(fēng)通絡(luò);雞血藤主要補(bǔ)血，活血通絡(luò);狗脊補(bǔ)肝腎，強(qiáng)腰膝;益母草活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫;川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛;赤芍清熱涼血，散瘀止痛。原標(biāo)準(zhǔn)僅選取忍冬藤及赤勺作為定性指標(biāo)，赤勺中芍藥苷作為定量指標(biāo)。有學(xué)者增加雞血藤、益母草、川芎的鑒別作為定性指標(biāo)，增加忍冬藤中綠原酸的含量測(cè)定，提高了盆炎凈片的質(zhì)量控制要求[2]。為更全面地控制藥品質(zhì)量，本試驗(yàn)中擬用高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測(cè)定盆炎凈片中原兒茶酸、咖啡酸、芍藥苷的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型Series高效液相色譜儀(四元泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱);TU－1221型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用);AE240型電子分析天平(梅特勒－托利多);SB2200型超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司)。乙腈、磷酸(色譜純)，純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán));原兒茶酸對(duì)照品(批號(hào)為809－200102)，咖啡酸對(duì)照品(批號(hào)為110885－200102)，芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)為110736－200934，含量95.7%)，均購于中國藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用;盆炎凈片(陜西白鹿制藥股份有限公司);忍冬藤、雞血藤、蒲公英、狗脊、川芎、益母草、車前草、赤勺等8味藥材均為市售品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Agilent Eclipse XDB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈－0.1%磷酸梯度洗脫，0～10 min時(shí)乙腈 8%和0.1%磷酸 92%，10～25 min時(shí)乙腈 14%和 0.1%磷酸 86%;流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長:219 nm;進(jìn)樣量:10 μL。在此條件下，3個(gè)組分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按原兒茶酸、咖啡酸、芍藥苷計(jì)均大于5 000(圖1)。

2.2 溶液制備

取盆炎凈片10片，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入15 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，過濾，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密稱取原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑分別制成質(zhì)量濃度為 1.4，1.4，0.6 g/L 的貯備液，并制備含原兒茶酸28μg/mL、咖啡酸28μg/mL和芍藥苷120μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):按處方制備分別不含雞血藤、蒲公英及赤勺原藥材的樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣。結(jié)果分別在原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷的對(duì)應(yīng)峰位上未出現(xiàn)色譜峰，說明陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無干擾(見圖1)。

線性關(guān)系考察:分別精密吸取對(duì)照品貯備液，采用等量遞減方法制得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn):將同一混合對(duì)照品溶液在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷峰面積的 RSD分別為0.7% ，0.4%，0.5%。

圖1 高效液相色譜圖

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，8，12 h時(shí)按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷峰面積的 RSD分別為0.8%，1.8%，1.0%，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為100306)，依法平行制備6份供試品溶液并進(jìn)樣分析。結(jié)果原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷含量平均值為 1.605 9，1.556 9，3.655 2 mg/g，RSD 分別為 1.2%，1.4% ，1.0%。

加樣回收試驗(yàn):分別取已知含量的樣品(批號(hào)為100306)6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品貯備液，揮干溶劑后按供試品溶液制備方法制備溶液并測(cè)定各成分的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 原兒茶酸、咖啡酸、芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

3 討論

將適當(dāng)質(zhì)量濃度的原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷對(duì)照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行吸收光譜掃描，結(jié)果原兒茶酸在259 nm和219 nm波長處有最大吸收，咖啡酸在323 nm和219 nm波長處有最大吸收，芍藥苷在229 nm波長處有最大吸收，經(jīng)綜合考量，最后確定測(cè)定波長為219 nm。

因本試驗(yàn)中成分靠近末端吸收，在色譜條件篩選試驗(yàn)中，比較乙腈－水、乙腈－1%磷酸、乙腈－0.1%磷酸溶液3個(gè)流動(dòng)相后，確定乙腈－0.1%磷酸為最終條件。當(dāng)進(jìn)樣量為20μL時(shí)，樣品過載，峰形嚴(yán)重前沿，而調(diào)整進(jìn)樣量為10μL后，則樣品峰形尖銳，對(duì)稱性良好。

考察使用溶劑時(shí)，曾采用甲醇、50%甲醇、乙醇對(duì)樣品進(jìn)行提取，結(jié)果甲醇的提取效率最高;后通過超聲15，20，30 min，回流1，1.5 h，振蕩等提取方法比較，得出用甲醇超聲提取20 min時(shí)提取效果最好，基線相對(duì)較平[5－6]。

含量測(cè)定中，不同批號(hào)樣品間咖啡酸含量差別較大。而咖啡酸會(huì)與奎尼酸反應(yīng)生成綠原酸[7]，是否因此原因?qū)е驴Х人岷坎环€(wěn)定，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]YBZ25272005，國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)[S].

[2]楊遁嘉，霍 昕，劉文煒，等.雞血藤顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中成藥，2009，3(1):144 －146.

[3]尹 偉，岳春華，雷 偉，等.盆炎凈片的質(zhì)量控制[J].中南藥學(xué)，2007，5(3):246 － 149.

[4]錢正明，李會(huì)軍，李 萍.高效液相色譜法測(cè)定忍冬藤和葉中8種活性成分[J].分析化學(xué)，2007，8(35):1 159 －1 163.

[5]鄧君麗，王兆霞.HPLC測(cè)定消炎片中咖啡酸的含量[J].中成藥，2007，29(4):615 －616.

[6]耿家玲，盂 芹.HPLC法測(cè)定燈盞細(xì)辛中綠原酸和咖啡酸的含量[J].中國藥師，2010，13(5):701 －702.

[7]孟 偉，溫亞男，魏永巨，等.金銀花中綠原酸含量的熒光法測(cè)定[J].分析化學(xué)，2009，37(A01):211.