阿維 A酸聯(lián)合干擾素誘導皮膚鱗癌細胞凋亡作用的實驗研究

林秀英,韓振東,尹淑紅,崔 堯

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院皮膚科,黑龍江 齊齊哈爾 161000)

皮膚癌是人類最常見的惡性腫瘤,尤其是發(fā)生于暴露部位的鱗狀細胞癌,發(fā)病率逐年上升,嚴重影響人類的身體健康。目前皮膚鱗狀細胞癌的治療手段主要是外科切除,人體最暴露部位的手術瘢痕會影響患者的美觀需求以及生活質量。近年來腫瘤的化學治療逐漸引起人們的重視,尤其是聯(lián)合用藥?？商岣忒熜А５谝淮S甲酸13-順維甲酸與干擾素α-2a(IFN α-2a)最早被應用于皮膚鱗狀細胞癌患者。第二代維甲酸依曲替酯和干擾素α聯(lián)合治療鱗狀細胞癌患者取得較好效果[1]。本研究探討第二代維甲酸阿維 A酸聯(lián)合干擾素 α-2a對皮膚鱗癌細胞 SCL-1的生長抑制、凋亡誘導作用,為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

阿維 A酸購自重慶華邦藥業(yè)公司。干擾素α-2a(IFNα-2a)購自長春生物制品研究所。細胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國 Hyclone公司。二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(M TT)為美 國 Sigma公 司產 品。Cell Death Detection ELISAPLUS試劑盒購于德國 Roche公司。Annexin-VFITC檢測試劑盒購自深圳晶美公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

SCL-1細胞系生長于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,置于5%CO2、37℃孵箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理及分組

阿維 A酸用 DMSO,IFN α用生理鹽水配制成儲存液-20°C保存,實驗時根據(jù)需要用培養(yǎng)液稀釋。實驗設溶媒對照組、不同濃度的單藥作用組和聯(lián)合用藥組,其中 IFN α按濃度不同分為100U/mL,500U/mL,1000 U/mL 3個亞組;阿維A酸分為0.1umol/L,1umol/L,10umol/L 3個亞組 ,聯(lián)合用藥組按單藥不同濃度進行組合。

1.2.3 細胞增殖抑制試驗

將 SCL-1細胞接種在96孔板上,于對數(shù)生長期按分組要求加入相應的處理因素 ,每組設6個復孔 ,培養(yǎng) 72 h后 ,加入 MTT20 μL,37℃孵 育 4h,棄上 清 液,每 孔 加 入 100μL DMSO,震蕩10min,酶標儀490nm測吸收光度(A)。細胞存活率=(加藥組 A值 /對照組 A值)×100%。

1.2.4 Cell Death Detection ELISA檢測細胞凋亡

將 SCL-1細胞接種在 96孔板上,根據(jù) M TT實驗結果分組如下:溶媒對照組,IFNα組 (100U/mL),阿維 A酸組(I umol/L)及二者合用組 (IFNα 100U/mL+阿維 A酸 I umol/L)。于對數(shù)生長期向細胞中分別加入各組藥物,培養(yǎng)72 h后按試劑盒說明書檢測凋亡。

1.2.5 Annxin-V和 PI結合實驗檢測早期凋亡

分別用 1umol/L阿維 A酸,100U/mL IFNα,及阿維 A酸聯(lián)合 IFNα作用于 SCL-1細胞72h后收集細胞 ,Annxin-V和 PI染色后,流式細胞儀檢測凋亡細胞。實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學處理

相應數(shù)據(jù)用 SPSS12.0統(tǒng)計包進行方差分析,以P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的阿維 A酸及 IFNα單用或聯(lián)用72h對 SCL-1細胞的生長抑制作用

三種用藥形式均可抑制 SCL-1細胞的生長,與溶媒對照組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。除100U/mL、500U/mL的 IFNα與0.1umol/L的阿維 A酸聯(lián)合外,其余各聯(lián)合用藥組與單用相比抑制作用明顯增強,且抑制作用隨濃度的增加而遞增。見表1。

表1 阿維 A酸 /干擾素 α對 SCL-1細胞的抑制率(%,±s)

表1 阿維 A酸 /干擾素 α對 SCL-1細胞的抑制率(%,±s)

*P ＜0.05與對照組比較;△P＜0.05與單獨應用阿維 A酸或干擾素比較。

2.2 阿維 A酸及 IFNα單用或聯(lián)用對 SCL-1細胞的凋亡誘導作用

方差分析 Cell Death Detection ELISA檢測結果,各組凋亡吸光度總體均數(shù)不等(F=80.35,P＜0.01)。進一步兩兩比較,100U/mL的 IFN-α,lumol/L的阿維 A酸及二者聯(lián)合應用均能誘導 SCL-1細胞凋亡,與溶媒對照組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。聯(lián)合用藥組對 SCL-1細胞凋亡的誘導作用顯著高于單用應用 IFNα或阿維 A酸組,差異有統(tǒng)計學意義 (P ＜ 0.05)。見圖1。

圖1 阿維 A酸、干擾素α作用 SCL-1細胞72h后的凋亡誘導情況

2.3 AnnexinV和 PI雙標記法檢測凋亡率

方差分析 Annxin-V和 PI結合實驗結果,各組早期凋亡率總體均數(shù)不等 (F= 66.03,P＜0.01)。進一步兩兩比較,100 U/mL的 IFNα,l umol/L的阿維 A酸及二者聯(lián)合應用均能誘導 SCL-1細胞早期凋亡,與溶媒對照組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。聯(lián)合用藥組對 SCL-1細胞凋亡的誘導作用顯著高于單用應用 IFN α或阿維 A酸組,差異有統(tǒng)計學意義 (P ＜ 0.05)。見圖2、圖3。

圖2 Annexin v和 PI雙標記法檢測阿維 A酸、干擾素α誘導 SCL-1細胞凋亡

圖3 阿維 A酸、干擾素α作用 SCL-1細胞72h后的早期凋亡率

3 討論

誘導腫瘤細胞凋亡的方法,除常規(guī)的化療、放療與激素治療,細胞因子的應用也越來越廣泛。體外實驗證明,采用聯(lián)合用藥的誘導凋亡療法,對腫瘤的治療可能是最有效可行的。因此,尋求有效的誘導腫瘤凋亡療法,成為目前腫瘤治療領域的一個熱點。維甲酸類化合物已證實對人類多種惡性腫瘤具有誘導分化、抑制增殖、誘導凋亡等作用[2]。由于存在對維甲酸的耐受、敏感性低的腫瘤類型,以及維甲酸所帶來的副作用,限制了它的臨床應用。為了解決這一問題,人們探索維甲酸與其它藥物聯(lián)合使用以提高腫瘤對維甲酸治療的敏感性,已經取得了一定的進展。已有研究證實阿維 A酸能夠抑制皮膚鱗癌細胞 SCL-1生長并誘導凋亡[3]。干擾素是細胞因子中的一個家族,具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等多種生物學功能[4]。IFNα能誘導皮膚鱗癌細胞凋亡[5,6],并抑制其增生。本研究應用細胞增殖抑制實驗檢測不同濃度阿維A酸、IFNα單獨或聯(lián)合應用對 SCL-1細胞的增殖抑制情況。該方法簡便、快速,所需細胞數(shù)較少,便于進行藥物敏感實驗,目前已廣泛用于臨床前抗癌藥物篩選研究。結果發(fā)現(xiàn),阿維 A酸、IFNα單獨或聯(lián)合應用72h均可抑制 SCL-1細胞增殖。聯(lián)合用藥與單獨用藥比較均具有顯著的差異,并且在一定范圍內有劑量依賴性,說明聯(lián)合應用具有協(xié)同抗癌作用。根據(jù)我們的 M TT實驗結果,選擇阿維 A酸1uM聯(lián)合IFN100U/mL組 ,阿維 A酸1uM組,IFN1000U/mL組及溶媒對照組作為后續(xù)實驗分組。Cell Death Detection ELISA及Annxin-V和 PI結合實驗檢測結果顯示,聯(lián)合應用阿維 A酸與 IFN對 SCL-1細胞的凋亡誘導作用明顯高于單獨應用阿維 A酸或 IFN,說明二者可協(xié)同誘導皮膚鱗癌細胞凋亡。綜上所述,本研究證實維 A酸與 IFNα聯(lián)合應用,可增效減毒,抑制 SCL-1細胞增殖并誘導其凋亡。阿維 A酸 /IFNα聯(lián)合應用為皮膚鱗癌的化療提供可選藥物組合,從分子角度深化了阿維 A酸與 IFN協(xié)同抗腫瘤的作用機制。從而為皮膚鱗癌的治療提供了新的思路。

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