透骨草提取物誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡及其相關(guān)機(jī)制研究①

于秀艷 曾常茜 高 松 王文龍 高海燕 劉曉峰 (吉林省腫瘤醫(yī)院，長(zhǎng)春 130012)

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是全球婦女中發(fā)病率僅次于乳腺癌而占第2位的惡性腫瘤，尋找和研制高效低毒的治療宮頸癌的藥物仍然是當(dāng)前宮頸癌研究工作的熱點(diǎn)［1-5］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，透骨草(Phryma leptostachya L．var．a(chǎn)siatica Hara)提取物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用［6］。本實(shí)驗(yàn)觀察透骨草提取物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用以及對(duì)Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響，旨在為透骨草提取物的研究與開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 藥品試劑及儀器 人宮頸癌Hela細(xì)胞由吉林省腫瘤研究所提供;RPMI1640、小牛血清和胰蛋白酶為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;MTT和DMSO為Sigma公司產(chǎn)品;藥物采自遼寧金州大黑山，經(jīng)王心毓老先生鑒定為透骨草科植物(Phryma leptostachya L．var．a(chǎn)siaticaHara);RS232型酶聯(lián)檢測(cè)儀為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn);BB16UV型CO2培養(yǎng)箱為德國(guó)Heraeus公司生產(chǎn)。

1．2 方法

1．2．1 透骨草提取物制備方法 加熱回流提取法:取干燥透骨草50克，加8倍量75%乙醇，提取2小時(shí)，過(guò)濾，濾液水浴濃縮成干膏。

1．2．2 熒光顯微鏡觀察Hela細(xì)胞形態(tài) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，調(diào)節(jié)為5×107cells/L，接種于6孔培養(yǎng)板，5%CO2，37℃孵育24小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌。實(shí)驗(yàn)組加入100μg/ml透骨草提取物的培養(yǎng)液2．0 ml，對(duì)照組加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液2．0 ml，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，消化并收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌2次后，1 000 r/min離心5分鐘，以PBS緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液密度為1×1010cells/L。取上述細(xì)胞懸液95μl，加入5μl吖啶橙(0．1 g/L)使吖啶橙終濃度為5μg/m l，置37℃孵箱中避光染色10分鐘，取上述混合液10μl滴于載玻片上，蓋玻片封片后于熒光顯微鏡觀察并攝片。

1．2．3 透射電鏡觀察Hela細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞，置5%CO2，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌。實(shí)驗(yàn)組加入100μg/ml透骨草提取物4 ml，對(duì)照組加入4 ml的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，0．25%胰蛋白酶消化，離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌。用1 ml PBS緩沖液混懸細(xì)胞，移入 EP管，2 000 r/min離心10分鐘，棄上清，以2．5%戊二醛4℃固定2小時(shí)，PBS緩沖液洗滌2次后，1%鋨酸4℃固定2小時(shí)，PBS緩沖液洗滌2次，乙醇梯度脫水，滲透包埋，以常規(guī)方法制備超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察Hela細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1．2．4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Hela細(xì)胞，調(diào)整為 4 ×105cells/ml，37℃，5%CO2培養(yǎng)12小時(shí)，棄培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組加入4 m l透骨草提取物，對(duì)照組加入4 ml RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。用0．25%胰蛋白酶消化，離心棄上清，PBS洗滌離心棄上清。用4℃預(yù)冷的PBS制成約1×106cells/ml的單細(xì)胞懸液。加入70%乙醇，搖勻，4℃固定24小時(shí)，1 000 r/min離心5分鐘，PBS洗滌，用PBS制成1 ml細(xì)胞懸液，加入RNase，37℃水浴1小時(shí)，再加入PI染液，避光4℃染色30分鐘后上機(jī)檢測(cè)計(jì)算凋亡率和細(xì)胞周期所占比例。

1．2．5 Western blot檢測(cè) Bcl-2 蛋白和 Caspase-3 蛋白表達(dá) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，貼壁后用100μg/ml透骨草提取物處理48小時(shí)，4℃收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解液，4℃離心5分鐘，收集上清，紫外分光光度法測(cè)定蛋白濃度。SDSPAGE分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉，加入一抗(兔抗人Bcl-2單克隆抗體及Caspase-3單克隆抗體)室溫孵育，TBST洗滌，加入二抗室溫孵育，TBST洗滌，加入ECL試劑，暗室曝光，顯影，定影，X光底片拍照，進(jìn)行光密度分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示。P＜0．05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2．1 透骨草提取物對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)的影響 熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，核大呈均勻一致的綠色熒光(圖1A);而100μg/ml透骨草提取物作用Hela細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核濃縮呈新月?tīng)钸吋?圖1B)。

圖1 熒光顯微鏡下觀察Hela細(xì)胞形態(tài)(×400)Fig．1 Hela cells image of fluorencencem icroscope(×400)

圖2 透射電鏡下觀察Hela細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×5 000)Fig．2 Hela cells image of transm ission electron m icroscope(×5 000)

2．2 透骨草提取物對(duì)Hela細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡觀察可見(jiàn)，對(duì)照組Hela細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞膜完整，細(xì)胞核染色質(zhì)均勻(圖2A);而100μg/ml透骨草提取物作用Hela細(xì)胞48小時(shí)后，Hela細(xì)胞表面突起和微絨毛減少，核斷裂、染色質(zhì)凝聚且邊緣化，有“出芽”現(xiàn)象(圖2B)。

2．3 透骨草提取物對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組 Hela細(xì)胞凋亡率為(7．39±1．12)%(圖3A);而100μg/ml透骨草提取物作用Hela細(xì)胞48小時(shí)后，Hela細(xì)胞凋亡率為(25．90 ±1．13)%(圖 3B)，顯著高于對(duì)照組(P＜0．01)。

2．4 透骨草提取物對(duì)Hela細(xì)胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響 100μg/ml透骨草提取物作用Hela細(xì)胞48小時(shí)后， Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比較顯著下降(P＜0．05，圖4)。

圖3 透骨草提取物對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響Fig．3 Effect of phryma leptostachya L．var asiatica Hara extract on Hela cells apoptosis

圖4 透骨草提取物對(duì)Hela細(xì)胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響Fig．4 The expression levels of Bcl-2 and Caspase-3 in Hela cells treated with phryma Leptostachya L．var．a(chǎn)siatica Hara extract

3 討論

透骨草為透骨草科植物透骨草Phryma leptostachya L．var．a(chǎn)siatica Hara 的干燥全草，其根及葉鮮汁對(duì)家蠅及三帶喙庫(kù)蚊的幼蟲(chóng)有強(qiáng)烈的毒性，倍半木酚素有殺螨作用。其功能為清熱解表，活血消腫。主治黃水蒼、濕疹、跌打損傷、骨折。本實(shí)驗(yàn)用熒光顯微鏡和透射電鏡從形態(tài)學(xué)觀察，首次發(fā)現(xiàn)100μg/ml透骨草提取物處理的Hela細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡的形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核濃縮呈新月?tīng)钸吋?。表面突起和微絨毛減少，核斷裂、染色質(zhì)凝聚且邊緣化，有“出芽”現(xiàn)象。進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，100μg/ml透骨草提取物處理的Hela細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，表明透骨草提取物可以誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。

Caspase-3是白介素1β轉(zhuǎn)換酶類(lèi)半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶。正常情況下，Caspase-3以無(wú)催化活性的酶原或前體形式存在于胞質(zhì)中。Caspase-3的活化通常繼發(fā)于Bcl-2介導(dǎo)的線粒體凋亡通路的發(fā)生，Bcl-2可阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔復(fù)合孔(MPTP)開(kāi)放從而使細(xì)胞色素C不能從線粒體釋放出來(lái)，從而阻止Caspase-3的激活，抑制細(xì)胞凋亡［7］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) Western blot發(fā)現(xiàn)，100μg/ml透骨草提取物可顯著下調(diào)Hela細(xì)胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。提示透骨草提取物可能通過(guò)抑制Bcl-2/Caspase-3通路誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。

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