實(shí)時(shí)熒光PCR和ELISA在乙型肝炎病毒檢測中的應(yīng)用價(jià)值

屈 丹

湖南省衡陽市婦幼保健院檢驗(yàn)科，湖南衡陽 421001

乙肝正在全世界蔓延，不同國家、地區(qū)的HBV的感染率強(qiáng)度有一定的差異,而我國屬于乙肝的高發(fā)地域,1~59歲人群中乙肝表面抗原攜帶率為7.18%,其中一定數(shù)量的乙肝病毒攜帶者能逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?并要及時(shí)接受相關(guān)治療。如今，在熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(FQ-PCR)不斷進(jìn)步的情況下，其快、穩(wěn)、準(zhǔn)的特點(diǎn)得到了充分的發(fā)揮，此項(xiàng)檢測技術(shù)在臨床上已得到大面積的推廣，尤其是在HBV-DNA的檢測中顯得至關(guān)重要，而用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)在HBV標(biāo)志物的檢測中只能提供病毒已侵入人體的數(shù)據(jù),用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)則可以知道患者體內(nèi)HBV的具體狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用FQ-PCR技術(shù)對(duì)2010年12月—2012年3月間在該院接受乙肝病毒檢測的217例血清標(biāo)本進(jìn)行 HBV-DNA檢測和ELISA技術(shù)進(jìn)行HBVM檢測，最后比較結(jié)果并進(jìn)行討論。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取患者血清標(biāo)本217例，并同時(shí)采用FQ-PCR技術(shù)對(duì)217例血清標(biāo)本進(jìn)行HBV-DNA檢測和ELISA技術(shù)進(jìn)行HBV-M檢測。

1.2 儀器與試劑

ELISA試劑盒；HBV-DNA的FQ-PCR試劑。B10680酶標(biāo)儀；ROTOR GENE 3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 方法

HBV-M檢測使用ELISA技術(shù)，實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果的判斷依照試劑說明書進(jìn)行。HBV-DNA檢測使用FQ-PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光法檢測核酸的擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作依照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

217例標(biāo)本由上述兩種技術(shù)同時(shí)進(jìn)行測定,由PCR技術(shù)檢測出的陽性率與ELISA技術(shù)檢測出的陽性率之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而 HBV-DNA陽性拷貝數(shù)與 ELISA技術(shù)檢測出的“大三陽”和“小三陽”兩組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 見表 1。

表1 ELISA檢測HBV-M和FQ-PCR檢測HBV-DNA的結(jié)果

3 討論

對(duì)于乙肝病毒的診斷主要是依靠血清特異性抗原、抗體與HBV-DNA的檢測,而運(yùn)用ELISA技術(shù)檢測HBV-M則是診斷患者是否感染HBV的傳統(tǒng)方法,它可以檢測出人體的免疫系統(tǒng)對(duì)HBV的具體反應(yīng)情況。PCR技術(shù)可以檢測乙肝患者血清中HBV-DNA的拷貝狀態(tài),反映患者的病理狀況,其提供的信息具有很高的參考價(jià)值，能在治療過程中起到至關(guān)重要的作用，幫助醫(yī)生選擇治療方案。FQ-PCR是在完全閉管的情況下進(jìn)行檢測,沒有必要進(jìn)行PCR的后處理,這樣能很好的避免交叉感染,同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)檢測技術(shù)持續(xù)監(jiān)測在PCR中的反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)變化的反應(yīng)情況,而熒光信號(hào)在某個(gè)閾值附近的循環(huán)周期和模板DNA的起始數(shù)量的對(duì)數(shù)值遵循一定的線性關(guān)系,根據(jù)該線性關(guān)系可以準(zhǔn)確定量起始模板,且此種定量法的準(zhǔn)確率高,能客觀地反應(yīng)出HBV的復(fù)制狀態(tài)[1]。

該實(shí)驗(yàn)用HBV-DNA的FQ-PCR檢測217例不同的乙肝病毒陽性血清標(biāo)本后,結(jié)果顯示HBV-DNA在不同類型的HBV-M陽性標(biāo)本中，甚至是全陰性標(biāo)本中都可以檢測出來,可是其檢出率之間卻有一定的差距,該結(jié)果提醒我們不能單單依據(jù)HBV的血清學(xué)檢查結(jié)果來判定患者攜帶的病毒是否有傳染性[2]。有些患者處于“窗口”期，就是所謂的病毒感染早期,病毒的擴(kuò)增僅僅限于部分人體組織中，如肝、淋巴等,而血液中極少含有病毒,故用ELISA檢測HBV-M過程中的靈敏度、準(zhǔn)確度較低,導(dǎo)致HBV的血清學(xué)檢測結(jié)果表現(xiàn)為全陰性。故用HBV-DNA方法對(duì)獻(xiàn)血人員的篩查就顯得非常重要。

該實(shí)驗(yàn)從 109例 HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性組患者中，檢測出10例陰性的血清HBV-DNA,而某些文獻(xiàn)曾有“大三陽”組患者的HBV-DNA陽性檢出率為100%的結(jié)論，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該結(jié)論有些許偏差，故并非所有“大三陽”患者都有傳播乙肝病毒的能力。造成此種現(xiàn)象的原因可能是乙肝病毒在肝細(xì)胞DNA中與抗原基因進(jìn)行全基因整合或表達(dá)，在肝細(xì)胞內(nèi)部只有抗原的表達(dá)而無病毒的擴(kuò)增,所以能在血清中檢測出各種類型的HBV抗原,但乙肝病毒卻沒有在血清中出現(xiàn)，造成了部分HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組患者的HBV-DNA檢測為陰性的現(xiàn)象,而在同種情況下，“小三陽”組的發(fā)生率(61.3%)要比“大三陽”組的發(fā)生率(9.2%)高出許多(P=0.024),雖然這些患者沒有傳播乙肝病毒的能力,但也不能說明患者已經(jīng)痊愈,有可能身體的某些組織發(fā)生病變，導(dǎo)致機(jī)體受損、免疫力降低等情況下，乙肝病毒很有可能會(huì)重新擴(kuò)增,使患者轉(zhuǎn)變成傳染源,故對(duì)該類型的患者需要進(jìn)行復(fù)查[3]。在“小三陽”組的標(biāo)本中HBV-DNA拷貝數(shù)>105的占HBV-DNA陽性組的20.8%,“大三陽”組卻占到了81.8%,明顯高出“小三陽”組(P<0.01),與國內(nèi)一些文獻(xiàn)的結(jié)論相比無太大的出入。除此之外,HBeAg陽性組的HBV-DNA檢出率要大大高于HBeAg陰性組 (P<0.05)，從此結(jié)果可以知道檢測HBeAg陰轉(zhuǎn)與抗-HBe并不代表患者已經(jīng)失去傳染能力，只是傳染性變小,有些患者體內(nèi)依然存在HBV擴(kuò)增的可能,此種情況可屬于前c區(qū)突變。這種突變將使HBeAg不能繼續(xù)產(chǎn)生,但HBV的擴(kuò)增受其影響較小,此類患者應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行抗病毒的治療。

4 結(jié)語

由上述研究可以看出,在判斷乙肝患者傳染性強(qiáng)弱方面上,HBV-DNA檢測能力要高于血清學(xué)的檢測指標(biāo),但血清學(xué)的檢測指標(biāo)在分析HBV感染、病理狀況或HBV-DNA的陰性結(jié)果但不能排除患者攜帶HBV的情況下,沒有其他的檢測方法能夠代替它。ELISA法是臨床診斷 HBV的傳統(tǒng)方法，具有易操作、成本低的特點(diǎn)，它可以檢測出人體的免疫系統(tǒng)對(duì)HBV的具體反應(yīng)情況，僅僅可以進(jìn)行定性分析，而不能進(jìn)行病毒的定量分析，故PCR定量檢測優(yōu)勢較大，值得我們大力推廣。

[1]谷香珍，張敬黨，王霞，等.乙肝免疫學(xué)檢測與 HBV-DNA的血清學(xué)檢測分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，33（3）：383.

[2]張蓓，楊曉云，劉蕊，等.熒光定量 PCR檢測 HBV-DNA與乙肝兩對(duì)半檢測結(jié)果的相關(guān)性討論[J].河北醫(yī)學(xué)，2006，12(9)：835-838.

[3]李金明.實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2009：190.