巴斯德畢赤酵母表達(dá)的人抑瘤素M發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物分析

孔 寧，高海成，劉國民，陳 月，周余來，顏煒群

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)用生物材料學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)與藥事管理學(xué)教研室，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科，吉林 長春 130041）

巴斯德畢赤酵母表達(dá)的人抑瘤素M發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物分析

孔 寧1，高海成2，劉國民3，陳 月1，周余來1，顏煒群1

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)用生物材料學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)與藥事管理學(xué)教研室，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科，吉林 長春 130041）

目的：研究巴斯德畢赤酵母表達(dá)的人抑瘤素M（hOSM）大規(guī)模發(fā)酵條件。方法：利用hOSM畢赤酵母高表達(dá)菌株，于試管水平進(jìn)行發(fā)酵pH條件的摸索，以補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式在80L發(fā)酵罐中對hOSM工程菌進(jìn)行3個批次的高密度發(fā)酵，控制和優(yōu)化各種發(fā)酵條件，通過SDS－PAGE對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果：最終確定在pH 5.0的FM21培養(yǎng)基中擴(kuò)增菌體，待菌體密度達(dá)190g·L－1時添加甲醇誘導(dǎo)，在發(fā)酵液pH 5.5的條件下，發(fā)酵溫度穩(wěn)定在28℃，通入空氣的流量為2vvm，轉(zhuǎn)速為650r·min－1，罐內(nèi)壓力為10P，溶解氧保持在25%左右，甲醇流加速度在9.3mL·h－1·L－1初始發(fā)酵液體積，誘導(dǎo)36h時結(jié)束發(fā)酵，hOSM占分泌總蛋白的28%，產(chǎn)量達(dá)到280mg·L－1。結(jié)論：應(yīng)用hOSM工程菌能夠進(jìn)行穩(wěn)定的發(fā)酵，為進(jìn)行下一步生物學(xué)功能測定提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。

抑瘤素M；畢赤酵母；發(fā)酵

抑瘤素 M（oncostatin M，OSM）是一種相對分子質(zhì)量約為28 000的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，屬于白細(xì)胞介素6（IL－6）家族中的一員，該家族成員之間顯示出相似的生物學(xué)功能，并均通過受體gp130亞單位進(jìn)行信號傳遞［1］。OSM具有廣泛的生物學(xué)活性，包括參與炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元再生、造血作用、重塑細(xì)胞外基質(zhì)及抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖等［2］。有報道［3－4］顯示：OSM對肺癌、胃癌、骨肉瘤、肝癌等還具有抑制其生長并誘導(dǎo)其分化的作用。健康人血清中OSM含量僅為24ng·L－1，故人們嘗試通過大腸桿菌［5］及哺乳動物細(xì)胞［6］等表達(dá)系統(tǒng)來獲取OSM，但表達(dá)量均較低，無法滿足對OSM的大量需求。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)能在甲醇誘導(dǎo)下進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，表達(dá)水平穩(wěn)定，易于放大培養(yǎng)，適用于大規(guī)模工業(yè)化高密度發(fā)酵工藝，培養(yǎng)成本低廉，自身分泌的蛋白非常少，且可以分泌表達(dá)，十分有利于產(chǎn)物分離純化［7］。同時，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)還不存在原核表達(dá)系統(tǒng)的內(nèi)毒素難以除去的問題，也不存在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的病毒和支原體污染等問題。本課題組前期已構(gòu)建了畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαC－h(huán)OSM，并獲得了hOSM的高表達(dá)菌株［8］。在搖瓶規(guī)模發(fā)酵表達(dá)的基礎(chǔ)上，本次研究進(jìn)一步利用80L發(fā)酵罐對hOSM工程菌進(jìn)行發(fā)酵，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為OSM的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及未來臨床應(yīng)用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑及儀器

巴斯德畢赤酵母hOSM菌株（PichiapastorisX33／Mut＋）由本室構(gòu)建并保存。YPD、BMGY、BMMY、FM21和PTM1培養(yǎng)基均采用Invitrogen公司提供的配方配制；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量Marker（低）購自TaKaRa公司；Bioflo 5000發(fā)酵罐購自NewBrunswick Scientific公司；恒溫?fù)u床購自Forma Scientific公司；凝膠分析系統(tǒng)購自Pharmacia公司；發(fā)酵用其他試劑均為北京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.2 畢赤酵母表達(dá)hOSM的pH值優(yōu)化

選取表達(dá)量最高的酵母菌株，分別在pH 2.5～6.5的范圍內(nèi)以0.5個單位為間隔進(jìn)行培養(yǎng)基pH值的優(yōu)化實驗。將選取菌株，于10mL YPD培養(yǎng)基中30℃、250r·min－1振蕩培養(yǎng)24h。分別取BMGY 8mL，加入1mL由1mol·L－1Na2HPO4和0.5mol·L－1檸檬酸配制成不同pH值的緩沖液，混勻后各加入1mL YPD培養(yǎng)的工程菌菌液，30℃、250r·min－1振蕩培養(yǎng)30h，使其光密度（A）600＝5。室溫3 000r·min－1離心5min，棄上清，沉淀中各加入BMMY 8mL，再加入1mL不同pH值的上述緩沖液，30℃、250r·min－1振蕩培養(yǎng)，每24h補(bǔ)充1次甲醇至終濃度0.5%，同時補(bǔ)充滅菌去離子水，使發(fā)酵液總體積保持不變，誘導(dǎo)168h。分別取不同pH值的發(fā)酵液各0.5mL，離心取上清，進(jìn)行SDS－PAGE分析。

1.3 種子液培養(yǎng)

將凍存的hOSM工程菌在YPD瓊脂板上（含zeocin 100mg·L－1）30℃劃線培養(yǎng)。至菌落長至約2mm，挑取單克隆菌落加入到10mL YPD培養(yǎng)液中，30℃、250r·min－1振蕩培養(yǎng)24h。將上述培養(yǎng)物加入到2LYPD培養(yǎng)液中，30℃、250r·min－1振蕩培養(yǎng)24h，至A600＝10。

1.4 酵母細(xì)胞生物量的積累

配制40LFM21培養(yǎng)基，加入80L發(fā)酵罐中，121℃、30min高壓滅菌。待發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基冷卻到28℃，用氨水調(diào)節(jié)FM21培養(yǎng)基pH值至5.0，加入48mL PTM1和18mL生物素貯備液。將2LYPD種子液倒入發(fā)酵罐中開始培養(yǎng)，此為第1階段即甘油培養(yǎng)擴(kuò)增菌體，發(fā)酵罐參數(shù)為：攪拌速度600r·min－1，罐內(nèi)壓力10P，溫度28℃，控制方式均為P－I－D，維持溶解氧值（DO）在25%～30%，必要時通入純氧。24h后DO值上升至接近100%時，按每升培養(yǎng)基加入12mL PTM1的比例在高壓滅菌后的50%甘油中加入PTM1，混勻后以18.2mL·h－1·L－1初始發(fā)酵液的速率泵入發(fā)酵罐中，至菌體濕重達(dá)190g·L－1。停止補(bǔ)加甘油后，待DO值上升至接近100%后，繼續(xù)維持“甘油饑餓”狀態(tài)30min，轉(zhuǎn)入甲醇誘導(dǎo)階段。

1.5 甲醇補(bǔ)料誘導(dǎo)hOSM表達(dá)

調(diào)節(jié)pH至最適誘導(dǎo)pH值，按照12mL·L－1比例在甲醇中加入PTM1，混勻后以3.6mL·h－1·L－1初始發(fā)酵液的速率加入到發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)，維持此低速率3h，以使酵母適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境。DO值穩(wěn)定后，甲醇的速率升為7.2mL·h－1·L－1初始發(fā)酵液，以此速率維持2h。之后提高補(bǔ)加甲醇的速率至10mL·h－1·L－1初始發(fā)酵液，同時檢測DO值和發(fā)酵液溫度，并判斷甲醇是否過量。若碳源受限，則加快補(bǔ)加甲醇的速率；若甲醇過量，則減慢補(bǔ)加甲醇的速率，直至合適的速度。甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段，每隔6h取樣1次，分析酵母菌生長狀態(tài)。甲醇誘導(dǎo)表達(dá)60h后結(jié)束發(fā)酵。

1.6 菌體光密度值分析

發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后于可見光波長600nm，以去離子水為對照進(jìn)行比色測定，A600＝讀值×稀釋倍數(shù)。

1.7 菌體濕重分析

取發(fā)酵不同時期的發(fā)酵液1mL，13 000r·min－1離心5min，去上清，稱量質(zhì)量。

1.8 hOSM分析

取發(fā)酵不同時期的發(fā)酵液0.5mL進(jìn)行SDS－PAGE分析，采用Band Scan軟件對凝膠圖片進(jìn)行光密度分析，顯示其純度，并用Bradford法對蛋白進(jìn)行精確定量。

2 結(jié) 果

2.1 試管水平表達(dá)hOSM的最佳pH值

在相對分子質(zhì)量約為28 000處可見hOSM表達(dá)，pH在5.5～6.0時表達(dá)效果最好，而pH值低于3.0時幾乎無hOSM的表達(dá)（圖1）。

圖1 不同pH條件下rhOSM發(fā)酵上清SDS－PAGE分析Fig.1 SDS－PAGE analysis of rhOSM fermentation supernatant at different pH values

2.2 hOSM發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 hOSM發(fā)酵液pH值和甲醇誘導(dǎo)時間的確定 pH值5.5時，添加甲醇即有hOSM的表達(dá)，隨著發(fā)酵時間的延長目的蛋白表達(dá)量逐漸升高，至甲醇誘導(dǎo)36h表達(dá)量達(dá)到高峰，此后繼續(xù)發(fā)酵則發(fā)酵液中hOSM表達(dá)量不僅未增加，反而明顯下降；pH值4.5時，甲醇誘導(dǎo)42h表達(dá)量才達(dá)到高峰，比pH 5.5條件下高峰出現(xiàn)延遲，且高峰時hOSM表達(dá)量也沒有pH 5.5條件下甲醇誘導(dǎo)36h時多；pH值6.5時，hOSM表達(dá)量明顯低于其他pH條件，且雜蛋白增加明顯。據(jù)此，確定hOSM發(fā)酵最佳pH條件為5.5，甲醇誘導(dǎo)時間為36h，hOSM表達(dá)量占總蛋白量28%，產(chǎn)量可達(dá)280mg·L－1。見圖2～4。

圖2 pH 4.5條件下rhOSM發(fā)酵上清SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of rhOSM fermentation supernatant at pH 4.5

圖3 pH 5.5條件下rhOSM發(fā)酵上清SDS－PAGE分析Fig.3 SDS－PAGE analysis of rhOSM fermentation supernatant at pH 5.5

2.2.2 hOSM發(fā)酵過程中A600和菌體濕重監(jiān)測結(jié)果 甲醇誘導(dǎo)階段，每隔6h取樣監(jiān)測A600和酵母細(xì)胞濕重。從圖5可以看出菌體濕重和A600在整個發(fā)酵過程當(dāng)中持續(xù)增長，18h之前酵母細(xì)胞生長相對緩慢。

2.2.3 溫度對hOSM發(fā)酵產(chǎn)量的影響 巴斯德畢赤酵母的適宜生長溫度為30℃，若溫度高于32℃對畢赤酵母是致命的。本次研究發(fā)酵溫度控制在28℃進(jìn)行發(fā)酵取得了很好的效果。

圖4 pH 6.5條件下rhOSM發(fā)酵上清SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE analysis of rhOSM fermentation supernatant at pH 6.5

圖5 pH 5.5條件下rhOSM中試發(fā)酵酵母菌發(fā)酵液A600、菌體濕重和發(fā)酵上清中rhOSM表達(dá)產(chǎn)量的經(jīng)時變化Fig.5 Profile of A600，wet weight，rhOSM production and time course during the methanol induction phase at pH 5.5

2.2.4 甲醇流加速度對hOSM發(fā)酵產(chǎn)量的影響對發(fā)酵表達(dá)hOSM而言，在甲醇流加速度為3.6mL·h－1·L－1時目的蛋白的表達(dá)量很少，當(dāng)甲醇的流加速度增加至7.2mL·h－1·L－1時，目的蛋白的表達(dá)量仍舊很低，本研究保持發(fā)酵液中甲醇濃度在0.5%～1.0%，甲醇最終的流加速度達(dá)到9.3mL·h－1·L－1初始發(fā)酵液體積時，hOSM的表達(dá)量達(dá)到280mg·L－1。

3 討 論

畢赤酵母在分泌表達(dá)外源蛋白的時候，培養(yǎng)基的pH條件對外源基因的表達(dá)至關(guān)重要，尤其在大規(guī)模發(fā)酵菌體高密度培養(yǎng)時更加突出。培養(yǎng)基pH值不同往往引起酵母菌代謝過程的改變，使表達(dá)產(chǎn)物的比例和質(zhì)量發(fā)生改變。確定適合的pH條件，既能提高目的蛋白的產(chǎn)量，又能抑制蛋白水解酶的活性，保持目的蛋白的穩(wěn)定。本研究所用的培養(yǎng)基為無機(jī)鹽類，pH過高易產(chǎn)生沉淀，同時為防止雜菌污染，在甘油擴(kuò)增階段培養(yǎng)基pH值設(shè)定為5.0，而在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段pH值恒定在5.5。

在誘導(dǎo)階段，甲醇既作為畢赤酵母的碳源被攝取，又能作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。盡管在一定范圍內(nèi)外源蛋白的產(chǎn)量與甲醇的飼給量呈正相關(guān)，但是甲醇的添加速度并非越快越好，速度過慢，達(dá)到目的蛋白產(chǎn)量高峰所需的誘導(dǎo)時間長，表達(dá)量低；速度過快，同樣會出現(xiàn)表達(dá)量減少，雜蛋白增加［9］。在誘導(dǎo)的早期，一般應(yīng)從低濃度甲醇逐漸增加至高濃度來進(jìn)行，甲醇過量會導(dǎo)致畢赤酵母的中毒，其在發(fā)酵液中的濃度不應(yīng)高于2%。對發(fā)酵表達(dá)hOSM而言，采用補(bǔ)料批式發(fā)酵的方法，在菌體濕重達(dá)到190g·L－1時進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，甲醇終流加速度設(shè)置為9.3mL·h－1·L－1初始發(fā)酵液體積，誘導(dǎo)36h，其表達(dá)量可達(dá)280mg·L－1。發(fā)酵過程中可同時監(jiān)測A600和菌體濕重，這2個指標(biāo)能良好地反映酵母菌的生長情況。酵母的培養(yǎng)溫度一般為28～30℃，本室已先后利用該發(fā)酵罐表達(dá)了10余種重組蛋白［10－12］，其最佳發(fā)酵溫度均在28℃，而本研究對hOSM發(fā)酵溫度設(shè)置為28℃，同樣取得了理想結(jié)果。

本研究除對發(fā)酵液pH值、甲醇誘導(dǎo)時間、溫度、甲醇流加速度等主要影響rhOSM發(fā)酵產(chǎn)量的因素進(jìn)行優(yōu)化之外，還對DO、培養(yǎng)基成分、消泡劑的使用等因素進(jìn)行了實驗，確定了在使用FM21培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為650r·min－1，通入空氣的流量為2vvm，純氧濃度為22%～30% （V／V），罐內(nèi)壓力為10P，DO值保持在25%左右，發(fā)酵后期適當(dāng)使用消泡劑的條件下，即可維持hOSM工程菌的代謝需要。

據(jù)報道，OSM已在大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞、重組腺病毒載體［13］中進(jìn)行表達(dá)，其中大腸桿菌中OSM 的表達(dá)量為2.3mg·L－1［5］，COS－7細(xì)胞中OSM 的表達(dá)量約為0.2mg·L－1［6］，其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本研究應(yīng)用的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，通過40L規(guī)模的發(fā)酵而獲得的280mg·L－1的產(chǎn)量，是其他表達(dá)體系產(chǎn)量的上百倍。這將為rhOSM產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］Heinrich PC，Behrmann I，Haan S，et al.Principles of interleukin （IL ）－6－type cytokine signaling and its regulation ［J］.Biochem J，2003，374（Pt 1）：1－20.

［2］Tanaka M，Miyajima A.Oncostatin M，a multifunctional cytokine ［J］.Rev Physiol Biochem Pharmacol，2003，149 （1）：39－52.

［3］Brounais B，David E，Chipoy C，et al.Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte－like differentiation on osteosarcoma and calvaria cells ［J］.Bone，2009，44 （5）：830－839.

［4］Yamashita T，Honda M，Nio K，et al.Oncostatin M renders epithelial cell adhesion molecule－positive liver cancer stem cells sensitive to 5－fluorouracil by inducing hepatocytic differentiation ［J］.Cancer Res，2010，70 （11）：4687－4697.

［5］Sporeno E，Barbato G，Graziani R，et al.Production and structural characterization of amino terminally histidine tagged human oncostatin M inE.coli［J］.Cytokine，1994，6 （3）：255－264.

［6］葉建新，盛偉華，馬麗麗，等.hOSM在COS－7細(xì)胞中表達(dá)及對人375黑色素瘤細(xì)胞的生長抑制作用 ［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2006，11 （2）：128－132.

［7］Krainer FW，Dietzsch C，Hajek T，et al.Recombinant protein expression in Pichia pastoris strains with an engineered methanol utilization pathway ［J］.Microb Cell Fact，2012，11 （1）：22－35.

［8］孔 寧，牟旭鵬，韓 冬，等.人抑瘤素M在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá) ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2008，34 （1）：42－45.

［9］Dietzsch C，Spadiut O，Herwig C.A fast approach to determine a fed batch feeding profile for recombinantPichiapastorisstrains［J］.Microbial cell factories，2011，10（1）：85－94.

［10］Shen M，Wang Q，Mu X，et al.Expression，purification and characterization of recombinant human beta－amyloid 1－42inPichia pastoris［J］.Protein Expr Purif，2009，63 （2）：84－88.

［11］Su M，Xu T，Wang D，et al.Expression and purification of recombinant human apolipoprotein C－I inPichiapastoris［J］.Protein Expr Purif，2011，78 （1）：22－26.

［12］Mu X，Kong N，Chen W，et al.High－level expression，purification，and characterization of recombinant human basic fibroblast growth factor inPichiapastoris［J］.Protein Expr Purif，2008，59 （2）：282－288.

［13］胡朝全，孫誠誼，孫連生，等.重組腺病毒載體介導(dǎo)HOSM基因?qū)Ω伟┘?xì)胞體外增殖的抑制作用 ［J］.世界華人消化雜志，2007，15 （7）：737－740.

Fermentation conditions of human oncostatin M expressed inPichiapastorisand analysis of fermentation products

KONG Ning1，GAO Hai－cheng2，LIU Guo－min3，CHEN Yue1，ZHOU Yu－lai1，YAN Wei－qun1
（1.Department of Biomedical Materials，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Clinical Pharmacy and Pharmacy Administration，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；3.Department of Orthopedics，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To optimize the fermentation condition of large scale fermentation of human oncostatin M（hOSM）with engineering strain ofPichiapastoris.Methods The optimal pH condition of hOSM expressed in the methylotrophic yeastPichiapastorisX－33in tube－scale was determined and fermentation of hOSM was performed in an 80Lfermentor in a fed－batch mode for three times.The pH value，culture medium，dissolved oxygen，temperature，methanol feeding speed，initial biomass and etc were focused mainly.hOSM was analyzed by SDS－PAGE.Results In the FM21medium of pH 5.0，when a cell yield of 190g·L－1wet weight was achieved，methanol induction phase began.In the fermentation broth of pH 5.5，the temperature was controlled at 28℃，a stirring speed of up to 650r·min－1，the pressure of fermentor was 10P，dissolved oxygen above 25%and the supply speed of methanol was 9.3mL·h－1·L－1initial fermentation volume，after methanol induction for about 36h，the expression level of hOSM reached 280mg·L－1.Conclusion OSM is successfully obtained through genetic engineering for large scale production of hOSM for following biological functions.

oncostatin M；Pichiapastoris；fermentation

Q78

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0943－05

2012－04－10

吉林省衛(wèi)生廳科研基金資助課題 （3D511AJ83432）

孔 寧 （1979－），女，吉林省吉林市人，講師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事醫(yī)學(xué)生物工程研究。

顏煒群 （Tel：0431－85619715，E－mail：weiqunyan＠jlu.edu.cn）