酶聯(lián)免疫法測(cè)定豬肉中磺胺類藥物的殘留

馮才偉 ，朱君紅 ，王會(huì)玲 ，羅曉琴 ，崔廷婷

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.河南眾品食業(yè)股份有限公司，河南 長(zhǎng)葛 461500）

目前，對(duì)動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物的殘留分析主要采用微生物法、理化法（HPLC、GC-MS、LC-MS/MS等）和免疫法（酶聯(lián)免疫法、免疫層析法等）。酶聯(lián)免疫法作為一種快速篩選方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的篩查，目前已在農(nóng)藥、獸藥殘留檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本與試劑 豬肉：市售；磺胺“十五合一”ELISA檢測(cè)試劑盒：北京勤邦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，其中包括包被有偶聯(lián)抗原的96孔酶標(biāo)板，濃度分別為0、1、3、9、27、81μg/L 的磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)液，酶標(biāo)二抗，抗體工作液，底物液A液和B液，終止液，20×濃縮洗滌液，2×濃縮復(fù)溶液；磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；乙腈、正己烷、氫氧化鈉：分析純，北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備 8010S勻漿機(jī)，2000SBL電子天平，KS-Ⅱ振蕩器，Anke GL-20G-Ⅱ高速離心機(jī)，DSY-Ⅲ氮吹儀，QL-901漩渦混合器，微量移液器（單道 20～200μL、100～1000μL，多道 50～300μL）：MK3 酶標(biāo)儀，Acquity液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 稱取2.0g±0.05g勻漿后的樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加入8mL乙腈-NaOH（0.1mol/L）溶液，立即用振蕩器振蕩5min，以4000r/min室溫（20～25℃）下離心5min后，取2mL上清液至10mL干凈玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加?mL正己烷，用漩渦混合器渦動(dòng)30 s溶解干燥殘留物，再加入0.5mL復(fù)溶液工作液，渦動(dòng)30s后轉(zhuǎn)入2mL離心管中，4 000 r/min室溫（20～25℃）下離心5min；除去上層正己烷相，取下層水相50μL用于分析。

1.2.2 檢測(cè)步驟 取出所需數(shù)量的微孔板，記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置；加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品溶液50μL到對(duì)應(yīng)的微孔中，然后加入抗體工作液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min；倒出孔內(nèi)液體，用洗滌工作液（250μL/孔）充分洗滌4～5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干；再加入酶標(biāo)二抗100μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，重復(fù)洗板步驟；加入底物液A液和B液各50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min；加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定每孔的吸光度。

1.2.3 結(jié)果計(jì)算

式中，A為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的吸光度；A0為空白液（濃度為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液）的吸光度。

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中磺胺類藥物的實(shí)際濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照1.2.2步驟，分別測(cè)定0、1、3、9、27、81μg/L磺胺甲惡唑標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。其中IC50值為4.6μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.9987。

2.2 檢測(cè)限 對(duì)20份空白豬肉樣本進(jìn)行檢測(cè)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)于各百分吸光率的濃度，以20份樣本磺胺類藥物濃度的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）來(lái)表示檢測(cè)限（MDL），即 MDL=+3s，結(jié)果獲得該方法對(duì)豬肉樣本的檢測(cè)限為1.5μg/kg。

圖1 磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 ELISA測(cè)定的準(zhǔn)確度用回收率表示，精密度用變異系數(shù)表示。以市售空白豬肉樣本為試驗(yàn)材料，向其中分別添加15種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，添加濃度為100、200μg/kg，計(jì)算回收率及精密度。結(jié)果表明所添加磺胺類藥物的回收率范圍在76.1%～101.7%，變異系數(shù)為4.6%～11.9%，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示試劑盒重復(fù)性較好。

2.4 特異性 試劑盒特異性用交叉反應(yīng)率表示：

式中，X為引起50%抑制的磺胺甲惡唑的濃度；Y為引起50%抑制的其他磺胺類藥物的濃度。

表1 試劑盒特異性試驗(yàn)

由表1可知，該試劑盒特異性良好，可用于檢測(cè)豬肉樣本中磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲噻二唑、磺胺喹惡啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺苯酰、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺（二甲基）異惡唑和酞酰磺噻唑15種磺胺類藥物的多殘留。

2.5 與LC-MS/MS作比對(duì)試驗(yàn) 隨機(jī)抽取50份豬肉樣本，分別用儀器方法與試劑盒方法檢測(cè)，儀器方法參考“GB/T 21316-2007動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法”（該標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)動(dòng)物組織中磺胺類藥物的檢測(cè)定量限為50μg/kg）。結(jié)果篩選出4份陽(yáng)性樣本（濃度大于50μg/kg），比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 ELISA法和LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果比較 μg/kg

由表2可知，ELISA法和LC-MS/MS法測(cè)定的結(jié)果基本一致，符合度基本達(dá)到100%，適用于豬肉樣本中磺胺類藥物多殘留的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究采用酶聯(lián)免疫法對(duì)豬肉中的磺胺類藥物殘留進(jìn)行了檢測(cè)，靈敏度為1μg/L，對(duì)豬肉樣本的最低檢測(cè)限為1.5μg/kg；以100、200μg/kg磺胺類藥物添加的豬肉樣本，其平均回收率為76.1%～101.7%，變異系數(shù)為4.6%～11.9%；與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比，檢測(cè)結(jié)果雖一致，但耗時(shí)短（75min）、樣本前處理簡(jiǎn)單、儀器設(shè)備投資少、成本低，適合對(duì)大量豬肉樣本中磺胺類藥物多殘留的快速檢測(cè)，有利于我國(guó)畜禽養(yǎng)殖戶、食品企業(yè)、政府監(jiān)管部門(mén)等開(kāi)展磺胺檢測(cè)工作。但目前酶聯(lián)免疫法篩選的檢測(cè)限不統(tǒng)一，結(jié)果判定較困難，還可能存在假陽(yáng)性問(wèn)題，因此對(duì)于陽(yáng)性樣本，需要用LC-MS/MS、GC-MS等儀器方法作進(jìn)一步確證。

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