食管鱗癌組織中PLK1表達(dá)變化及其對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲遷移的影響

范平明，鄭武平，高炳玉

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，?？?70102)

Polo樣激酶1(PLK1)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中呈周期依賴性表達(dá)的絲/蘇氨酸激酶，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。2006年6月～2012年3月，我們觀察了食管鱗癌組織中PLK1的表達(dá)變化，及其對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并初步探討了其可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 食管鱗癌80例，男61例，女19例;年齡25～77歲，平均45歲;術(shù)前未行放化療。于2006年6月～2008年6月行食管癌手術(shù)，術(shù)中留取腫瘤及癌旁正常組織標(biāo)本，TNM分期T1～T2期56例，T3～T4期24例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期40例;病理分級(jí)G0～G1級(jí)39例，G2～G3級(jí)41例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。術(shù)后患者均進(jìn)行化療、放療等規(guī)范性治療，隨訪至2012年3月31日。

1.2 方法

1.2.1 食管鱗癌組織中PLK1的檢測(cè) 采用免疫組化SP法。組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 μm;SP染色，抗原修復(fù)采用檸檬酸鈉緩沖液微波修復(fù);以已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。PLK1陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核深褐色染色。高倍鏡下選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜10%為陰性，≥10%為陽(yáng)性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將人食管癌EC9706細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞以6×105/mL接種于6孔板，每孔1 mL;培養(yǎng)16 h后，觀察組用PLK1 siRNA(5'-GGGACATAGCCAAGCTGGTCGAGTACTGGACCAGCTT-GGCTATGTCCC-3'，由Invitrogen公司合成)經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Scrambled siRNA(與人類基因組序列無(wú)同源性，由Invitrogen公司合成);繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞按1∶10傳代，然后加入G418進(jìn)行篩選;每隔2～3 d換液1次，10～14 d有明顯克隆形成。

1.2.3 食管癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的觀察 采用Transwell試驗(yàn)。EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h后，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基饑餓12 h，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。每個(gè)小室加100 μL細(xì)胞懸液，下室加600 μL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。其中侵襲實(shí)驗(yàn)在小室接種細(xì)胞前一晚，將基質(zhì)膠(Matrigel)用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為1∶7，每個(gè)小室加60 μL，而遷移試驗(yàn)不加Matrigel。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，侵襲試驗(yàn)28 h后再行遷移試驗(yàn)20 h;取出小室用90%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察并拍照;在相同的低倍視野(×100)下，分別選取視野中央和上下、左右5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.2.4 食管癌細(xì)胞中 PLK1、MMP-2、MMP-9 的檢測(cè)采用Western blot法。用蛋白裂解液(Thermo公司)提取兩組培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白，用分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度。每孔上樣20 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳 (濃縮膠8%，分離膠12%);蛋白分離后半干轉(zhuǎn)至PVDF膜(30 V，42 min)，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗人 PLK1 抗體、MMP-2、MMP-9，以鼠抗人β-actin抗體作為內(nèi)參。4℃搖床過夜，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG;室溫孵育 2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。用 One-Dscan軟件檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)參蛋白電泳條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度比值表示目的蛋白表達(dá)量;實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。PLK1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析;組間計(jì)量資料比較用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌及癌旁組織中PLK1的表達(dá)情況食管鱗癌組織中PLK1陽(yáng)性表達(dá)53例(66.3%)，高于癌旁組織中的27 例(33.7%)，P ＜0.05。

2.2 PLK1表達(dá)與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系PLK1表達(dá)與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P均 ＜0.05)，與患者的年齡、TNM 分期、腫瘤病理分級(jí)無(wú)關(guān)(P均＜0.05)。見表1。

表1 PLK1表達(dá)與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 PLK1表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系 PLK1陰性者5年生存率為62%，高于PLK1陽(yáng)性者的39%，P＜0.05。以食管癌臨床預(yù)后作為因變量，以有關(guān)影響因素作為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、PLK1表達(dá)均為食管癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。詳見表2。

表2 食管鱗癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

2.3 PLK1表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 觀察組細(xì)胞侵襲遷移個(gè)數(shù)分別為(120±6)、(269±8)個(gè)/HP，對(duì)照組分別為(468±11)、(780±12)個(gè)/HP;兩組比較，P 均 ＜0.05。

2.4 敲降PLK1表達(dá)對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 觀察組PLK1、MMP-2、MMP-9灰度比值分別為0.10±0.03、0.40±0.02、0.87±0.05，對(duì)照組分別為 0.96±0.05、0.98± 0.07、0.89± 0.06;兩組 PLK1、MMP-2灰度比值比較，P 均 ＜0.05。

3 討論

PLK1在細(xì)胞有絲分裂中扮演重要角色，與細(xì)胞有絲分裂期多個(gè)事件密切相關(guān)，如中心體復(fù)制、紡錘體形成、染色體分離以及胞質(zhì)分裂等［1］。近年來(lái)研究［2～4］發(fā)現(xiàn)，PLK1在多種實(shí)體腫瘤組織中高表達(dá)，提示其與腫瘤發(fā)生相關(guān);進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PLK1高表達(dá)與一些腫瘤組織分級(jí)、惡性程度及腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，PLK1在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，而與腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)，PLK1高表達(dá)者的生存期顯著低于低表達(dá)者;進(jìn)一步的多因素分析表明，PLK1表達(dá)、臨床分期、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都是食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。以上這些結(jié)果表明，PLK1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。其表達(dá)升高可能有助于惡性腫瘤細(xì)胞逃脫檢測(cè)點(diǎn)監(jiān)控，突變基因得以復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤形成。

鑒于PLK1表達(dá)與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的不良預(yù)后有關(guān)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了PLK1表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降PLK1表達(dá)，可顯著降低食管癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。腫瘤的侵襲遷移須完成三個(gè)過程，即降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白質(zhì)、黏附ECM生長(zhǎng)、離開ECM向其他器官遷移［5］。在此過程中，MMP起關(guān)鍵作用。MMP是一種重要的蛋白水解酶，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)26種亞型，MMP既參與ECM的降解，又可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附及運(yùn)動(dòng)［6］。其中MMP-2在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］。ECM降解是腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該過程的完成主要依靠蛋白水解酶的降解作用。MMP-2以酶原的形式分泌，被激活之后形成Ⅳ型膠原酶，降解、破壞靠近腫瘤表面的ECM和基底膜，然后腫瘤細(xì)胞沿著缺失的基底膜向周圍組織浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致腫瘤的浸潤(rùn)和遷移［8，9］。MMP-9可降解基底膜中的主要成分Ⅳ型膠原及明膠等，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成等重要作用［10，11］。為了進(jìn)一步研究PLK1影響食管癌細(xì)胞侵襲遷移的分子機(jī)理，我們觀察了PLK1表達(dá)對(duì)與腫瘤侵襲遷移密切相關(guān)的MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降PLK1表達(dá)可抑制MMP-2的表達(dá)水平，提示PLK1對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響可能是通過影響MMP-2的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，但這種作用是直接的還是間接的需要進(jìn)一步深入研究。

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