附子不同炮制品提取物急性毒性的比較研究

謝曉芳，彭成，易進(jìn)海，胡海燕，唐正偉

附子為毛茛科（Ranunculaceae）植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是四川道地藥材之一。附子味辛、甘，性大熱，有毒，歸心、腎、脾經(jīng)，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛等功效，堪稱“回陽救逆第一藥”。自古以來附子的毒性為醫(yī)家所重視，并具有久煎、炮制、配伍、控制用量等多種傳統(tǒng)制毒方法。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中通過現(xiàn)代研究方法證實(shí)了附子煎煮時(shí)間、用藥劑量、配伍的傳統(tǒng)控制方法的科學(xué)性[1～2]。當(dāng)前附子的炮制品多達(dá)十余種，其中以黑順片和白附片的臨床使用最為廣泛。因此，本課題選用此兩種常用炮制品及泥附子的標(biāo)準(zhǔn)水提物和醇提物，比較6個(gè)提取物的急性毒性，為全面揭示附子毒性和指導(dǎo)臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

黑順片水提物（每g相當(dāng)于生藥2.294 g）、黑順片醇提物（每g相當(dāng)于生藥8.621 g）、白附片水提物（每g相當(dāng)于生藥2.305 g）、白附片醇提物（每g相當(dāng)于生藥6.192 g）、泥附子水提物（每g相當(dāng)于生藥1.523 g）、泥附子醇提物（每g相當(dāng)于生藥4.386 g）。以上均由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所易進(jìn)海教授提供，按《中國藥典》2010版附子項(xiàng)下雙酯型生物堿的含量測定以上6個(gè)提取物含次烏頭堿的量分別為0.003%、0.025%、0.002%、0.025%、0%、0.013%。臨用時(shí)各藥用蒸餾水配成剛好能通過12號(hào)灌胃針的濃度或其他所需濃度。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重18～22 g；SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重180～220 g，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（川）2008-11）。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：成都中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（TCM-2009-315）。

1.3 主要儀器

PA2003型電子分析天平，上海天平儀器廠。

2 方法

2.1 附子不同炮制品醇提物灌胃小鼠半數(shù)致死量（LD50）試驗(yàn)

經(jīng)預(yù)試，泥附子、黑順片和白附片醇提物灌胃小鼠均可引起動(dòng)物全部死亡，故采用改良的Bliss法進(jìn)行LD50測定[3～4]。通過反復(fù)預(yù)試驗(yàn)確定3種醇提物灌胃小鼠的100%致死量（Dm）和0%致死量（Dn）。正式試驗(yàn)時(shí)取健康、合格SPF級(jí)昆明種小鼠50只，適應(yīng)環(huán)境后按體重隨機(jī)分為5組，各組10只，雌雄各半。按下式求出劑量比（r）以確定各組給藥劑量。

上式中r指相鄰兩組間劑量比值，N指正式試驗(yàn)的組數(shù)，即5。結(jié)果按此法算得黑順片醇提物、白附片醇提物、泥附子醇提物的組間劑量比r值分別為0.88、0.80、0.90。以Dm為最高劑量、Dn為最低劑量，按r值計(jì)算出中間3個(gè)劑量。3個(gè)醇提物各組給藥劑量見表1～3。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水14 h，按40 mL.kg-1分別灌胃相應(yīng)濃度藥液，然后密切觀察小鼠的反應(yīng)并及時(shí)記錄。從第2 d起常規(guī)飼養(yǎng)，每天觀察2次，連續(xù)14 d，記錄動(dòng)物的反應(yīng)和死亡情況。死亡動(dòng)物進(jìn)行剖檢，肉眼觀察臟器變化。未死亡動(dòng)物至14 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后脫頸椎處死，剖檢肉眼觀察臟器變化。

2.2 附子不同炮制品水提物灌胃小鼠最大耐受量試驗(yàn)

經(jīng)預(yù)試，黑順片、白附片和泥附子的水提物灌胃昆明種小鼠雖可引起毒性反應(yīng)，甚至引起個(gè)別動(dòng)物死亡，但不能引起動(dòng)物全部死亡，故均進(jìn)行最大給藥量測定[5]。正式試驗(yàn)時(shí)3個(gè)提取物分別試驗(yàn)。取健康、合格SPF級(jí)昆明種小鼠40只，適應(yīng)環(huán)境后按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組，每組20只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水14 h，然后空白對(duì)照組小鼠灌胃蒸餾水40 mL.kg-1，給藥組灌胃相應(yīng)藥液40 mL.kg-1，黑順片水提物、白附片水提物和泥附子水提物的給藥濃度按原生藥計(jì)分別為1.222、1.475、1.160 g.mL-1，黑順片水提物和白附片水提物24 h內(nèi)灌胃1次，泥附子水提物24 h內(nèi)灌胃2次，兩次給藥間隔12 h，空白對(duì)照組給藥次數(shù)與相應(yīng)給藥組一致。給藥后密切觀察兩組小鼠的一般狀態(tài)和反應(yīng)。然后各組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)14 d，逐日觀察小鼠的精神活動(dòng)、進(jìn)食、大小便、自發(fā)活動(dòng)、被毛、四肢活動(dòng)等并詳細(xì)記錄可能出現(xiàn)的毒性表現(xiàn)及其開始和消失時(shí)間，于給藥后第1、7、14 d稱體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將動(dòng)物脫頸椎處死，剖檢肉眼觀察臟器變化。

2.3 附子不同炮制品水提物灌胃大鼠急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試，黑順片、白附片和泥附子水提物灌胃大鼠無法測得LD50，故進(jìn)行最大給藥量測定。正式試驗(yàn)時(shí)3個(gè)提取物分別試驗(yàn)。取健康、合格SPF級(jí)SD大鼠40只，適應(yīng)環(huán)境后按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組，每組20只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水14 h，24 h內(nèi)灌胃2次，兩次給藥間隔12 h，給藥體積20 mL.kg-1，3個(gè)提取物的給藥濃度同小鼠最大耐受量試驗(yàn)，空白對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水。給藥后密切觀察兩組小鼠的一般狀態(tài)和反應(yīng)。各組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)14 d，逐日觀察小鼠的精神活動(dòng)、進(jìn)食、大小便、自發(fā)活動(dòng)、被毛、四肢活動(dòng)等，并詳細(xì)記錄可能出現(xiàn)的各種毒性表現(xiàn)及其開始和消失時(shí)間，于給藥后第1、7、14 d稱體重，第1、3、4、7、14 d測定攝食量，第3、14 d各組分別取10只大鼠處死，剖檢肉眼觀察臟器變化，并取心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、腎上腺稱重，計(jì)算臟器系數(shù)[臟器系數(shù)=臟器濕重（g）/動(dòng)物體重（g）×100%]。

2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件形成數(shù)據(jù)庫后，LD50的計(jì)算采用Curvilinear Regression進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；其它數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較分析。

3 結(jié)果

3.1 附子不同炮制品醇提物灌胃小鼠毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 LD50及95%可信區(qū)間測定結(jié)果 黑順片醇提物灌胃小鼠的LD50為49.853 g生藥.kg-1（相當(dāng)于提取物5.783 g.kg-1），95%可信區(qū)間為（45.804～54.636）g生藥.kg-1；白附片醇提物灌胃小鼠的LD50為42.550 g生藥.kg-1（相當(dāng)于提取物6.872 g.kg-1），95%可信區(qū)間為（38.221～47.828）g生藥.kg-1；泥附子醇提物灌胃小鼠的LD50為22.16 g生藥.kg-1（相當(dāng)于提取物5.054 g.kg-1），95%可信區(qū)間為（21.043～23.513）g生藥.kg-1?？梢姡喔阶哟继嵛锏腖D50值最小。結(jié)果詳見表1～3。

表1 黑順片醇提物灌胃小鼠LD50試驗(yàn)結(jié)果

表2 白附片醇提物灌胃小鼠LD50試驗(yàn)結(jié)果

表3 泥附子醇提物灌胃小鼠LD50試驗(yàn)結(jié)果

3.1.2 毒性反應(yīng) 3個(gè)醇提物灌胃小鼠后，均可引起動(dòng)物死亡，但毒性反應(yīng)在不同劑量時(shí)稍有區(qū)別。在最大劑量時(shí)，小鼠灌胃后即出現(xiàn)活動(dòng)減少、扎堆、聳毛，5 min內(nèi)出現(xiàn)呼吸困難，口周流涎或口吐白沫，張口呼吸，繼之出現(xiàn)跳躍、抽搐，多在30 min內(nèi)死亡，其中泥附子醇提物高劑量給藥10 min即可致小鼠死亡。對(duì)死亡動(dòng)物立即剖檢見心臟充血，胸腔無明顯液體，胃內(nèi)大量殘留藥液，腸壁充血，腸管充盈內(nèi)有大量腸液，其余臟器均未見異常。該毒性反應(yīng)多出現(xiàn)于泥附子醇提物。在中、小劑量時(shí)灌胃后動(dòng)物即出現(xiàn)活動(dòng)減少、扎堆、聳毛，5～10 min出現(xiàn)口周流涎或張口呼吸，30 min后部分動(dòng)物出現(xiàn)大、小便失禁致肛周污穢，1 h后伏地不能站立，精神極度萎靡，反應(yīng)遲鈍，多在3～24 h內(nèi)安靜死亡。死亡動(dòng)物尸體解剖發(fā)現(xiàn)心尖部顏色變淡，胃內(nèi)大量殘留藥液，腸管無充盈，管壁呈瘀血狀，其余臟器均未見明顯異常。該毒性反應(yīng)主要見于黑順片和白附片醇提物。存活動(dòng)物在給藥后亦出現(xiàn)上述類似毒性反應(yīng)，但隨后緩解，多在灌胃后24 h內(nèi)毒性反應(yīng)消失，觀察14 d一般狀態(tài)、進(jìn)食、體重等均正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)束剖檢各臟器無明顯病理變化?？傮w而言，泥附子醇提物毒性反應(yīng)出現(xiàn)最早，表現(xiàn)最嚴(yán)重。

3.2 附子不同炮制品水提物灌胃小鼠毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 最大耐受量測定結(jié)果 黑順片、白附片和泥附子水提物灌胃小鼠后觀察14 d，雖均出現(xiàn)一定毒性反應(yīng)，但不引起動(dòng)物死亡，最大給藥量分別為48.80 g生藥.kg-1，（相當(dāng)于提取物21.273 g.kg-1）、59.00 g生藥.kg-1（相當(dāng)于提取物25.597 g.kg-1）、92.80 g生藥.kg-1（相當(dāng)于提取物60.932 g.kg-1）。

3.2.2 毒性反應(yīng) 黑順片水提物和白附片水提物灌胃后，小鼠出現(xiàn)少動(dòng)、扎堆、聳毛、活動(dòng)減少，部分動(dòng)物在給藥5～10 min出現(xiàn)呼吸困難，30 min后出現(xiàn)大便失禁，或口周流涎，精神逐級(jí)萎靡，反應(yīng)遲鈍，但多在2～4 h內(nèi)毒性反應(yīng)消失。隨后觀察14 d一般狀態(tài)、進(jìn)食等均正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)束剖檢各臟器無明顯病理變化。泥附子水提物給予24 h內(nèi)灌胃2次，在第1、2次灌胃后動(dòng)物均出現(xiàn)少動(dòng)、扎堆、聳毛、活動(dòng)減少，無明顯呼吸困難、口周流涎、二便失禁等其他毒性表現(xiàn)，且多在2～4 h內(nèi)恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束剖檢各臟器無明顯病理變化。

與空白對(duì)照組比較，黑順片水提物在實(shí)驗(yàn)第7、14 d體重較空白對(duì)照組降低，泥附子水提物對(duì)小鼠體重有降低趨勢，白附片水提物在給藥后第1、7、14 d對(duì)小鼠體重?zé)o明顯異常。結(jié)果見表4。

表4 附子不同炮制品水提物灌胃對(duì)小鼠體重的影響（x±s）

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3.3 附子不同炮制品水提物灌胃大鼠急性毒性試驗(yàn)

3.3.1 對(duì)一般體征的影響 附子3個(gè)炮制品的水提物灌胃大鼠后均可引起大鼠少動(dòng)、扎堆、聳毛、活動(dòng)減少等反應(yīng)，其中黑順片水提物和白附片水提物可致部分動(dòng)物呼吸困難，或大便溏稀，多在給藥后2 h內(nèi)毒性反應(yīng)逐級(jí)減弱，24 h基本恢復(fù)正常。3個(gè)水取物中以泥附子水提物的毒性反應(yīng)最輕；同一水提物灌胃大鼠的毒性表現(xiàn)較灌胃小鼠輕。

3.3.2 對(duì)大鼠體重和攝食量的影響 黑順片水提物和白附片水提物灌胃大鼠后第1 d體重較空白對(duì)照組顯著下降，白附片水提物使大鼠攝食量在第1 d也呈明顯降低趨勢。隨后黑順片水提物和白附片水提物組大鼠體重和攝食量變化與空白對(duì)照組一致。泥附子水提物灌胃后大鼠體重變化與空白對(duì)照組保持一致，攝食量變化與空白對(duì)照組比較無明顯異常。結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 附子不同炮制品灌胃大鼠急性毒性試驗(yàn)對(duì)大鼠體重的影響

圖2 附子不同炮制品灌胃大鼠急性毒性試驗(yàn)對(duì)大鼠攝食量的影響

3.3.3 對(duì)大鼠重要臟器系數(shù)的影響 各組大鼠在給藥后第3 d和第14 d分別取10只大鼠脫頸椎處死后剖檢，肉眼觀察見胸腺和腹腔內(nèi)無積液、積血等異常，各臟器解剖位置、大小、色質(zhì)等均無明顯異常。剖取心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、腎上腺稱重計(jì)算臟器系數(shù)。由表5、表6可見，黑順片水提物在給藥第3 d使大鼠胸腺系數(shù)減小，至第14 d無異常；白附片水提物在給藥后第3 d使大鼠肝臟系數(shù)明顯降低，第14 d心臟系數(shù)明顯降低；泥附子水提物在給藥后第3 d對(duì)上述臟器系數(shù)無明顯影響，僅在第14 d致心臟系數(shù)升高。

表5 附子不同炮制品水提物灌胃大鼠急性毒性試驗(yàn)第3 d對(duì)大鼠重要臟器系數(shù)的影響（x±s）

表6 附子不同炮制品水提物灌胃大鼠急性毒性試驗(yàn)第14 d對(duì)大鼠重要臟器系數(shù)的影響（x±s）

4 討論

附子的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)較為清楚，主要是其所含脂溶性雙酯型生物堿，包括烏頭堿（aconitine）、新烏頭堿（mesaconitine）和次烏頭堿（hypaconitine）等。烏頭堿內(nèi)服0.2 mg即可引起中毒，3～4 mg即可引起死亡。本研究顯示，三種附子炮制品的醇提物毒性均較水提物毒性大，這與附子毒性部位在脂溶性部位的既往研究成果一致。

附子中的二萜雙酯類生物堿是由氨基醇類衍生的酯型生物堿，親脂性較強(qiáng)，不穩(wěn)定，在加熱和酸堿條件下水解為苯甲酰單酯型生物堿，毒性降低，然后可進(jìn)一步于C14位的苯甲?；獬捎H水性的氨基醇類生物堿，毒性更低。因此使用蒸法和煮法對(duì)附子進(jìn)行炮制后附子毒性明顯降低。有研究報(bào)道白附片、黑附片的總生物堿含量下降為原生藥的1/6～1/9，而雙酯型烏頭堿類生物堿的含量只相當(dāng)于原藥的1/100左右，鹽附子總生物堿與上述附片類似，而雙酯型生物堿含量明顯高于白附片、黑附片[6]。本研究顯示，附子3個(gè)炮制品的醇提物灌胃小鼠的LD50按生藥量算從小到大分別是泥附子（22.169 g.kg-1）、黑順片（49.853 g.kg-1)和白附片（42.550 g.kg-1)，以泥附子的毒性反應(yīng)出現(xiàn)最快，表現(xiàn)最強(qiáng)烈，可在給藥后3 min即引起呼吸困難，口吐白沫，最快10 min即引起死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，泥附子醇提物毒性最大，黑順片和白附片醇提物毒性相對(duì)較小，這與炮制后黑順片、白附片中二萜雙酯型生物堿減少有關(guān)。

附子不同炮制品水提物急性毒性試驗(yàn)顯示，黑順片水提物、白附片水提物和泥附子水提物分別按生藥量分別以48.80、59.00、92.80 g.kg-1灌胃小鼠和48.80、59.00、46.40 g.kg-1灌胃大鼠，觀察14 d均不引起動(dòng)物死亡，為其最大給藥量。3個(gè)水提物均可引起小鼠、大鼠少動(dòng)、扎堆、聳毛、活動(dòng)減少等毒性反應(yīng)，其中黑順片水提物和白附片水提物可致部分動(dòng)物呼吸困難，或大便溏稀，且使小鼠、大鼠給體重明顯降低。相對(duì)而言泥附子水提物灌胃毒性反應(yīng)較輕，對(duì)大鼠體重?zé)o明顯影響，說明黑順片水提物48.80 g.kg-1（相當(dāng)于人臨床日用量的195.2倍）和白附片水提物59.00 g.kg-1（相當(dāng)于人臨床日用量的236.0倍）灌胃小鼠、大鼠的急性毒性較泥附子水提物92.80 g.kg-1（相當(dāng)于人臨床日用量的371.2倍）灌胃小鼠和46.40 g.kg-1（相當(dāng)于人臨床日用量的185.6倍）灌胃大鼠的毒性大。

附子是目前少有的毒性研究較為全面的有毒中藥，已報(bào)道的毒性靶器官主要是神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和消化系統(tǒng)，其主要毒性成分烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞[7]、大腦皮質(zhì)神經(jīng)元[8]、睪丸支持細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞[9]、結(jié)腸ICC細(xì)胞[10]、肝臟細(xì)胞[11]、腎小管上皮細(xì)胞[12]等均有細(xì)胞毒性。烏頭類有毒中藥引起的不良反應(yīng)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，附子的中毒癥狀以神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)為主[13～14]。我們的研究顯示，3種水提物灌胃大鼠對(duì)脾、肺、腎、腎上腺、腦的臟器系數(shù)無明顯影響，對(duì)心和肝臟系數(shù)有一定影響，其中黑順片水提物灌胃3 d可引起大鼠胸腺系數(shù)明顯下降，提示胸腺亦可能是其急性毒性靶器官，在以后的研究中可結(jié)合病理和免疫功能檢測等探討。

綜上表明，附子的醇提部位較水提部位毒性大，是其主要的毒性部位。3個(gè)醇提物比較，泥附子毒性最大，黑順片和白附片醇提物毒性相對(duì)較小。3種炮制品的水提物毒性雖明顯低于醇提物，但仍有急性毒性，在臨床應(yīng)用黑順片和白附片時(shí)應(yīng)從控制煎煮方法、把握給藥劑量、掌握適應(yīng)病證和合理配伍等多途徑控制毒性，發(fā)揮療效。

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