EDTA滴定法測(cè)定附子不同炮制品中的鈣元素含量

耿昭，郭力，姚志昂，周勤梅，何成軍，熊亮

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的側(cè)生子根及加工品。被譽(yù)為亂世良將，回陽(yáng)救逆之第一品，補(bǔ)先天命門真火之第一要藥[1]。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，列為下品，為攻邪要藥。臨床上一般不用生附子而用其炮制品，其炮制方法自唐代以后更加豐富起來(lái)，主要有白附片、黑順片、鹽附子等?！侗窘?jīng)》曰：“其味辛溫有大毒”，仲景炮附子有去皮、火炮。后世云：“古人用火炮，正是去其毒也”[3]，附子的炮制解毒[4～5]經(jīng)歷了火炮-液體輔料制-蒸制的過(guò)程，自漢代延續(xù)至今。

2010版《中國(guó)藥典》收載了附子的三種炮制品鹽附子、白附片、黑順片，生附子在2010版《中國(guó)藥典》并未收載，但在張仲景的《傷寒論》中很多處方使用了生附子而非炮制品，主要原因是當(dāng)今附子藥材種植面積較大，采收后如不經(jīng)歷膽巴水處理很容易變質(zhì)腐爛，因此本研究中我們將生附子及各炮制品一并加以對(duì)照。由于膽巴水中含有大量鈣元素，對(duì)附子不同炮制品中鈣元素含量影響很大。本研究中采用的EDTA滴定法測(cè)定附子不同炮制品中鈣元素的含量無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，使用常規(guī)儀器就能得出可靠結(jié)果，較其他方法更為簡(jiǎn)便快捷，并節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

1 材料與儀器

1.1 藥材與飲片

白附片（20101001）、黑順片（20101001）購(gòu)自四川佳能達(dá)攀西藥業(yè)有限公司，生附子（20101001）、鹽附子（20101001）購(gòu)自江油恒源藥業(yè)集團(tuán)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室李敏教授鑒定為道地藥材。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器 酸式滴定管，高溫烘箱，錐形瓶，坩堝，各種規(guī)格的容量瓶等。

1.2.2 試劑 (1) 鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取2.780g 無(wú)水氯化鈣溶于水中，然后定容至100mL，得10mg/mL鈣標(biāo)準(zhǔn)液。(2) 0.01mol/L EDTA溶液：精密稱取1.8537g EDTA于500mL容量瓶中，加水溶解后定容即得。(3)2 mol/LNaOH溶液：稱取4.00gNaOH于燒杯中，溶解冷卻后轉(zhuǎn)入50mL容量瓶，定容。(4) 1 mol/LNaOH溶液：稱取2.00gNaOH于燒杯中，溶解冷卻后轉(zhuǎn)入50mL容量瓶，定容。(5) 1 mol/LHCl溶液：用移液管量取5.00mL濃鹽酸于50mL容量瓶中，加水至刻度即得。(6)鈣指示劑：稱取0.10g鈣指示劑，加氯化鈉10g，放入潔凈研缽內(nèi)研磨成細(xì)粉，裝入玻璃瓶中備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鈣的測(cè)定方法

取250mL錐形瓶，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)液，加入蒸餾水50mL左右，加入2mol/LNaOH 2mL，加入鈣指示劑0.05g。用0.01mol/ L EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由紫紅色變?yōu)榧兯{(lán)色即為終點(diǎn)。根據(jù)EDTA 用量和樣品量求出鈣的含量。

2.2 樣品的制備

2.2.1 藥材樣品的制備 將黑順片、白附片、鹽附子、生附子粉碎至過(guò)二號(hào)篩，在60℃烘2小時(shí)，在干燥器中冷卻至室溫，依次精密稱取5.0045g、5.0028g、5.0023g、5.0017g置于瓷坩堝中，于電熱板上先低溫炭化至無(wú)煙，移入高溫爐中，于600℃灰化5.5小時(shí)，取出冷卻，加10%鹽酸溶液10mL使溶解，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用水洗滌容器多次，合并洗滌液于容量瓶中，用1mol/LNaOH調(diào)pH6～8，定容，制得0.1g/mL黑順片、白附片、鹽附子、生附子藥材的樣品溶液。

2.2.2 煎煮液樣品制備 分別精密稱取已粉碎成小顆粒的黑順片 10.00g、白附片 10.01g、鹽附子10.02g、生附子 10.02g分別裝于500mL圓底燒瓶中，加水100mL，加熱回流1小時(shí)，趁熱用濾布過(guò)濾，用清水洗滌殘?jiān)?次，過(guò)濾，分別合并濾液。分別收集殘?jiān)偌铀?00mL，加熱回流1小時(shí)，過(guò)濾，洗滌3次并過(guò)濾，分別合并濾液。將同一原料的前后兩次濾液合并，得到黑順片、白附片、鹽附子、生附子的水煎液。用蒸發(fā)皿將四種藥材的水煎液揮干并用高溫?zé)福?mL 1mol/LHCl溶解，過(guò)濾于50mL容量瓶，用水多次洗滌殘?jiān)謩e合并濾液，然后用1mol/LNaOH調(diào)濾液pH6～8，定容，制得0.2g/mL黑順片、白附片、鹽附子、生附子煎煮后的樣品溶液。

2.3 測(cè)定鈣的條件試驗(yàn)

2.3.1 EDTA的標(biāo)定 取250mL錐形瓶，加入5mL鈣標(biāo)準(zhǔn)液，加入蒸餾水50mL，加入2mol/L NaOH 2mL，加入鈣指示劑0.05g。用0.01mol/L EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由紫紅色變?yōu)榧兯{(lán)色即為終點(diǎn)。平行測(cè)定3次。將“加入5mL的鈣標(biāo)準(zhǔn)液”改為“加入5mL蒸餾水”，依法測(cè)定，記錄結(jié)果。平行測(cè)定3 次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：“加入5mL鈣標(biāo)準(zhǔn)液”對(duì)應(yīng)的平均讀數(shù)是10.2mL?！凹尤?mL蒸餾水”對(duì)應(yīng)的平均讀數(shù)是0.3mL。

2.3.2 鈣指示劑的用量 實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)鈣指示劑低于0.04g時(shí)，顯色效果不明顯，顏色太淡；當(dāng)高于0.06g時(shí)，顏色太深，不好判斷終點(diǎn)。因此選用0.05g為指示劑的用量。

2.3.3 NaOH的用量 NaOH主要用來(lái)調(diào)節(jié)pH值，pH值為12.5時(shí)準(zhǔn)確度最高，重現(xiàn)性最好，因此選擇NaOH的用量為2mL。

3 測(cè)定結(jié)果及對(duì)比

取黑順片、白附片、鹽附子、生附子藥材樣品及煎煮液樣品，依鈣元素測(cè)定方法測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1計(jì)算平均值；并進(jìn)行對(duì)比分析，對(duì)比分析如圖1。

溶出率計(jì)算：溶出率=（水煎液樣品中鈣元素含量 / 藥材樣品中鈣元素含量）×100%

表1 各樣品鈣元素測(cè)定結(jié)果(單位：mg/Kg)

圖1 附子各炮制品鈣元素的含量及溶出率對(duì)比

結(jié)果表明，附子不同炮制品藥材和水煎煮液中鈣元素含量由大到小依次為：鹽附子>黑順片>白附片>生附子；溶出率由高到低依次為：鹽附子>白附片>黑順片>生附子。

4 討論

4.1 從生附子及其炮制品藥材中鈣元素含量來(lái)看，炮制品中的鈣元素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生附子，因三種炮制品都經(jīng)過(guò)膽巴水的浸泡，而膽巴水中含有大量的鈣元素，鈣元素是此過(guò)程引入。而生附子中的鈣元素含量應(yīng)為其自身從土壤中獲得，因此幾種炮制品中鈣元素含量減去生附子當(dāng)中的鈣元素含量后得到的才是幾種炮制品在炮制過(guò)程中獲得的鈣元素含量。鹽附子中鈣元素含量最高，原因是雖然其炮制過(guò)程中與白附片、黑順片都經(jīng)過(guò)膽巴水溶液浸泡，但并未經(jīng)過(guò)漂洗，經(jīng)過(guò)漂洗后，鹽附子藥材中鈣元素含量為白附片藥材的56倍，為黑順片藥材的4倍。從溶出率來(lái)看，各炮制品差異明顯，其中白附片和黑順片溶出率較鹽附子低，主要原因也應(yīng)該是漂洗后使得膽巴水附著在藥材表面的含量降低，因此可以用溶出率來(lái)衡量炮制對(duì)藥材中無(wú)機(jī)元素含量的影響。

4.2 生附子經(jīng)過(guò)膽巴水浸泡后制為鹽附子，一方面為了方便保存，另一方面則是為了減毒增效。文獻(xiàn)[6]研究表明，鈣離子具有調(diào)整心律，降低毛細(xì)血管和細(xì)胞膜的通透性，維持體內(nèi)酸堿平衡的作用。而附子中的毒性成分烏頭類生物堿常常引起心律失常，鈣元素的引入可能就是為了制其毒性；當(dāng)然，膽巴水本身對(duì)人體具有毒性，過(guò)多的鈣元素引入亦可能會(huì)造成不良反應(yīng)，因此白附片和黑順片經(jīng)過(guò)漂洗后制得，其鈣元素含量均有所降低，在臨床上更為常用。由此可見，附子的炮制通過(guò)改變鈣元素含量可以使其更加安全有效以適合臨床應(yīng)用。

4.3 對(duì)附子不同炮制品中鈣元素含量研究的文獻(xiàn)并不多[7～14]，雖然報(bào)道不完整，仍可以看出炮制對(duì)中藥附子中鈣元素的含量影響很大。對(duì)中藥材中鈣元素含量測(cè)定方法常用的有容量分析法[15～16]、原子吸收分光光度法[17～18]、可見-紫外分光光度法[19]、毛細(xì)管電泳法[20]、ICP-AES法[21]等，本研究采用的EDTA滴定法測(cè)定附子不同炮制品中鈣元素含量未見報(bào)道，而結(jié)果與文獻(xiàn)[7]采用ICP-AES法報(bào)道附子炮制品中鈣含量大量增加相符，但與其生附子、白附片及黑順片的鈣元素含量相差較大，可能是測(cè)定方法差異及藥材產(chǎn)地、批次、炮制方法差異引起的，因此對(duì)更多附子不同產(chǎn)地、炮制品種及批次的藥材進(jìn)行研究和加以驗(yàn)證完善將是今后進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

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