不同劑量電子線照射宮頸癌細(xì)胞后紅外光譜研究*

陳長(zhǎng)青，魏英耐，潘志峰，刁振琦，張建民，饒鳳飛，唐偉躍，齊 鍵

(鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

1 引言

宮頸癌指發(fā)生在宮頸的鱗狀上皮細(xì)胞及宮頸管內(nèi)膜的柱狀上皮細(xì)胞交界處的惡性腫瘤。在全球婦女惡性腫瘤中宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二種最常見的惡性腫瘤。在發(fā)展中國(guó)家婦女中其發(fā)病率居第一位。據(jù)國(guó)際癌癥研究中心(IARC)近年估計(jì)五年患病為1558000，其中100余萬(wàn)在發(fā)展中國(guó)家，30余萬(wàn)在發(fā)達(dá)國(guó)家。我國(guó)是一個(gè)宮頸癌患病率和死亡率均占世界三分之一的大國(guó)，每年新發(fā)病例有13.5 萬(wàn)人［1］。

放療是近年來(lái)治療惡性腫瘤最常用的手段之一，放療就是用放射線對(duì)腫瘤患者采取的一種治療手段。70%以上的腫瘤患者都需要采用放療才能得到緩解或治愈。因此研究新的檢測(cè)、分析階段性腫瘤治療應(yīng)用前景甚廣。

傅立葉變換紅外光譜可以反映分子水平的結(jié)構(gòu)和化學(xué)變化，因而在生物、化工等相關(guān)研究領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)隨著振動(dòng)光譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，用傅立葉變換紅外光譜方法研究腫瘤已屢有報(bào)道。構(gòu)成組織和細(xì)胞的基本物質(zhì)是核酸、蛋白質(zhì)、糖和磷脂等，因此細(xì)胞和組織的紅外光譜應(yīng)是這些成分及其相互作用的表征。在組織癌變的過(guò)程中，這些組分含量、構(gòu)型、構(gòu)象、分子間及分子內(nèi)相互作用等方面的改變均會(huì)發(fā)生變化。

本研究就是利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和傅立葉變換紅外光譜技術(shù)，研究不同劑量的電子射線輻照對(duì)人宮頸癌細(xì)胞內(nèi)部各成分的影響。采用不同劑量的電子射線輻照宮頸癌細(xì)胞后，必然會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的生物大分子造成一定的輻射損傷，從而改變其構(gòu)象和含量。通過(guò)采集輻照不同劑量放射線的細(xì)胞的傅立葉變換紅外光譜，可以發(fā)現(xiàn)不同輻照條件下細(xì)胞內(nèi)部的差異性與規(guī)律性，進(jìn)而從分子水平揭示細(xì)胞中的某些生物大分子的含量、構(gòu)象發(fā)生的變化。采集紅外光譜，方便、快捷、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，從物理學(xué)能級(jí)結(jié)構(gòu)的角度來(lái)研究癌細(xì)胞受放射線損傷后的變化，可以為臨床腫瘤治療提供一定的實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

細(xì)胞:人宮頸癌細(xì)胞株(購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù))。

儀器:37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱、小型臺(tái)式離心機(jī)TGL－16G(由河南省生物工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室提供);美國(guó)Varian 2300C/D直線加速器(由鄭州大學(xué)腫瘤醫(yī)院提供);德國(guó)CHRIST冰凍干燥機(jī)，型號(hào)ALPHA1－2LD(由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院提供);美國(guó)NicoletIR200傅立葉變換紅外光譜儀(由鄭州大學(xué)化學(xué)系提供)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

樣品制備:

分別取相同數(shù)量的處于指數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌細(xì)胞，分成 5 個(gè)劑量組(2Gy，6Gy，9Gy，11Gy，15Gy)和一個(gè)空白對(duì)照組(0Gy，對(duì)照組除不受電子線照射外，所處環(huán)境條件和其他各組完全一樣)，各組下設(shè)三個(gè)平行組。按設(shè)定劑量對(duì)各劑量組進(jìn)行電子線照射，然后置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。

胰蛋白酶消化、離心機(jī)離心、三蒸水清洗之后收集細(xì)胞至離心管，放入冰凍干燥機(jī)中冰凍干燥24小時(shí)后研磨成粉末，取1mg左右的樣品粉末與200mg左右的KBr粉末混勻后壓制成薄膜狀KBr壓片，鹵化物片基KBr在整個(gè)中紅外區(qū)是透明的，所以對(duì)樣品的紅外光譜幾乎沒(méi)有影響，將KBr壓片樣品置于傅立葉變換紅外光譜儀的光路上進(jìn)行紅外光譜的采集。

儀器參數(shù)設(shè)置:

直線加速器參數(shù)設(shè)定:電子線能量為12MeV，源皮距100cm，照射野面積10×10cm2。

紅外光譜儀參數(shù)設(shè)定:光譜范圍4000cm－1－400cm－1，分辨率1cm－1，掃描次數(shù)16 次。

4 光譜分析討論

電子線照射宮頸癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，分別采集4000cm－1－400cm－1范圍內(nèi)空白對(duì)照組和各劑量組的FTIR光譜，如圖1所示(圖中所標(biāo)注數(shù)字分別表示設(shè)定的劑量 0，2，6，9，11，15Gy)各組細(xì)胞不管是從峰形還是強(qiáng)度上呈現(xiàn)不同變化，但基本趨勢(shì)相同，11Gy劑量組在2000cm－1－2500cm－1波段特殊變化是受水分子影響，但其余生物大分子的特征峰與以往實(shí)驗(yàn)相比未有差別，因此不予考慮?？v觀紅外譜圖的差異性說(shuō)明電子線照射宮頸癌細(xì)胞影響細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)新陳代謝，改變物質(zhì)相對(duì)含量，對(duì)抑制宮頸癌細(xì)胞無(wú)限繁殖起到一定積極的作用。

結(jié)合圖1紅外光譜峰位對(duì)蛋白質(zhì)分子N－H基團(tuán)振動(dòng)譜帶，酰胺Ⅰ譜帶、酰胺II譜帶，磷酸二酯基團(tuán)(PO2－)的伸縮振動(dòng)譜帶分析如下。

圖1 電子線照射宮頸癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)

4.1 蛋白質(zhì)分子N－H基團(tuán)振動(dòng)譜帶

圖2 N－H基團(tuán)振動(dòng)譜帶

如圖2所示，宮頸癌細(xì)胞蛋白質(zhì)分子中的N－H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)譜帶位于3413cm－1處。經(jīng)不同劑量電子線照射后，波數(shù)變化顯示，除9、11Gy劑量組波數(shù)變小外，其他劑量組波數(shù)普遍變大，其中9Gy劑量組波數(shù)減小最明顯。根據(jù)N－H基團(tuán)伸縮振動(dòng)譜帶向低波數(shù)頻移，N－H基團(tuán)的氫鍵化程度變大［2］，電子線與蛋白質(zhì)分子碰撞時(shí)，損失能量提供給N－H基團(tuán)促使其氫鍵化，造成9，11Gy劑量組譜帶頻率向低波數(shù)頻移。

吸收強(qiáng)度變化顯示，各劑量組吸收強(qiáng)度減小，9Gy劑量組減小量大于其余各劑量組。這表明，在所設(shè)定劑量組中，9Gy劑量組宮頸癌細(xì)胞N－H基團(tuán)氫鍵化程度變大造成N－H基團(tuán)含量大幅度減少，綜合以上兩方面表明，與其他劑量組相比，9Gy電子線可以影響宮頸癌細(xì)胞蛋白質(zhì)分子中的N－H基團(tuán)結(jié)構(gòu)及含量，破壞宮頸癌細(xì)胞原有蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞趨于正常。

4.2 蛋白質(zhì)分子的酰胺Ⅰ譜帶、酰胺II譜帶

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征與氫鍵的形成方式緊密相關(guān)，這種氫鍵結(jié)構(gòu)的差異能夠在對(duì)于氫鍵敏感的紅外光譜中得到反映。將酰胺I帶和II帶結(jié)合起來(lái)定量分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量可以揚(yáng)長(zhǎng)避短，更加準(zhǔn)確地分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖3所示，空白對(duì)照組中1654cm－1、1542cm－1處的吸收峰分別歸屬于蛋白質(zhì)分子的酰胺Ⅰ帶、酰胺II帶。經(jīng)不同劑量電子線照射后，譜帶頻移顯示，酰胺Ⅰ帶基本沒(méi)有頻移。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［3］，癌組織中酰胺II帶波數(shù)高于正常組織對(duì)應(yīng)譜帶波數(shù)，考慮到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)論α－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角或其他構(gòu)象，都有其特定的氫鍵結(jié)構(gòu)，推斷蛋白質(zhì)分子間的氫鍵遭到破壞，構(gòu)象變得疏松無(wú)序，使吸收峰向低波數(shù)移動(dòng)，從而表現(xiàn)出酰胺II譜帶移。

取不同劑量1654cm－1、1542cm－1處的相對(duì)強(qiáng)度比I1654/I1542，如圖4所示，在所設(shè)定的各劑量組中，I1654/I1542在9Gy組中最小。腫瘤組織中酰胺Ⅰ帶、II帶的相對(duì)峰強(qiáng)比I1654/I1542明顯高于正常組織，I1654/I1542可以作為判斷組織癌化程度的一個(gè)有效指標(biāo)［4］。說(shuō)明宮頸癌細(xì)胞在9Gy時(shí)的癌化程度最小，由此判斷該劑量電子線照射能夠更大程度地抑制宮頸癌細(xì)胞的新陳代謝，促使惡變細(xì)胞內(nèi)部蛋白質(zhì)相對(duì)含量減少，細(xì)胞良性轉(zhuǎn)化效果較明顯。綜合頻移和相對(duì)吸光度，9Gy劑量以破壞蛋白質(zhì)分子氫鍵為途徑，改變蛋白質(zhì)分子中二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

4.3 磷酸二酯基團(tuán)(PO2－)的伸縮振動(dòng)譜帶

DNA是公認(rèn)的射線作用靶，無(wú)論是射線直接還是間接作用都能造成細(xì)胞中DNA結(jié)構(gòu)的損傷［3］。紅外光譜中磷酸二酯基團(tuán)對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜帶和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜帶是研究核酸分子構(gòu)象的主要譜帶?？瞻讓?duì)照組宮頸癌細(xì)胞磷酸二酯基團(tuán)對(duì)稱伸縮振動(dòng)νs(PO2－)譜帶對(duì)應(yīng)于1084cm－1，反對(duì)稱伸縮振動(dòng)νas(PO2－) 譜帶對(duì)應(yīng)于1236cm－1。

圖5 PO2－振動(dòng)譜帶圖

譜帶頻移如圖5所示，1084cm－1譜帶普遍向高波數(shù)頻移，9，11，15Gy高波數(shù)頻移幅度小;1236cm－1譜帶普遍向高波數(shù)頻移4－6cm－1。有文獻(xiàn)報(bào)道，癌組織中，當(dāng)振動(dòng)頻率為1220cm－1左右時(shí)，磷酸二酯基團(tuán)基本上被氫鍵所結(jié)合，反對(duì)稱伸縮振動(dòng)頻率為1240cm－1～1260cm－1時(shí)，磷酸二酯基團(tuán)完全沒(méi)有被氫鍵結(jié)合［4］。反對(duì)稱伸縮振動(dòng)頻率表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)不同劑量電子線照射后，癌細(xì)胞內(nèi)的磷酸二酯基團(tuán)完全沒(méi)有被氫鍵結(jié)合，這表明大劑量照射更易阻止磷酸二酯基團(tuán)結(jié)合氫鍵，可能是抑制其組織癌細(xì)胞繼續(xù)惡化的有效途徑。

如圖6所示，圖中:1反映各劑量組與空白對(duì)照組磷酸二酯基團(tuán)反對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜帶相對(duì)吸收強(qiáng)度，2反映各劑量組與空白對(duì)照組磷酸二酯基團(tuán)對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜帶相對(duì)吸收強(qiáng)度。1，2圖形相似，表現(xiàn)為均在9Gy組出現(xiàn)相對(duì)強(qiáng)度最小值;鑒于相對(duì)吸收強(qiáng)度側(cè)面反映物質(zhì)含量變化，說(shuō)明9Gy劑量組磷酸二酯基團(tuán)含量減少，而單核苷酸借磷酸二酯基團(tuán)相互連接形成的多核苷酸鍵是核酸的基本結(jié)構(gòu)。磷酸二酯基團(tuán)含量減少必然引起核酸含量減少，有報(bào)道稱腫瘤細(xì)胞中DNA和RNA含量增多，核酸分子中強(qiáng)度增加，從側(cè)面反映，細(xì)胞癌變過(guò)程中，核酸含量增加，細(xì)胞無(wú)限增殖的特性［5］。綜合頻移和相對(duì)強(qiáng)度變化推斷9Gy劑量組最大程度地減少核酸含量及其構(gòu)象，抑制宮頸癌細(xì)胞無(wú)限增殖，從根本上改變了宮頸癌細(xì)胞進(jìn)一步惡化的趨勢(shì)。

圖6 各劑量組PO2－(νs和νas)與對(duì)應(yīng)空白組

5 結(jié)語(yǔ)

綜合生物統(tǒng)計(jì)分析和光譜分析方法，分析不同劑量電子線照射宮頸癌細(xì)胞的傅立葉變換紅外光譜數(shù)據(jù)，得到以下結(jié)論:

1)不同劑量電子線照射宮頸癌細(xì)胞，3413cm－1在9Gy劑量組波數(shù)減小最明顯，電子線與蛋白質(zhì)分子碰撞時(shí)，損失能量提供給N－H基團(tuán)促使其氫鍵化，造成9Gy劑量組譜帶頻率向低波數(shù)頻移;1542cm－1帶普遍紅移，蛋白質(zhì)分子間的氫鍵遭到破壞，構(gòu)象變得疏松無(wú)序，使吸收峰向低波數(shù)移動(dòng)，表現(xiàn)出酰胺II譜帶紅移;1084cm－1譜帶普遍向高波數(shù)頻移，1236cm－1譜帶普遍向高波數(shù)頻移4 －6cm－1，阻止磷酸二酯基團(tuán)結(jié)合氫鍵可能是其抑制癌細(xì)胞繼續(xù)惡化的有效途徑。

2)不同劑量 1654cm－1、1542cm－1處的相對(duì)強(qiáng)度比I1654/I1542在9Gy組中最小，說(shuō)明宮頸癌細(xì)胞在9Gy組以破壞蛋白質(zhì)分子氫鍵為途徑，改變蛋白質(zhì)分子中二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量，更大程度地抑制宮頸癌細(xì)胞的新陳代謝，該組的癌化程度最小。

綜合以上，初步推斷電子線照射普遍影響宮頸癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸、脂類分子構(gòu)象。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定劑量中，無(wú)論從譜帶頻移還是譜帶強(qiáng)度變化角度分析，9Gy電子線照射影響宮頸癌細(xì)胞的效果都最明顯，9Gy電子線可作為臨床上電子線治療宮頸癌的有效參考劑量。

［1］宋學(xué)紅，王秋曦，宋玉芳.影視陰道鏡在子宮頸病變?cè)\斷中的應(yīng)用［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2001，36(5):278－281.

［2］高體玉，慈云祥，李峻.應(yīng)用傅立葉變換紅外光譜研究白血病骨髓血紅細(xì)胞［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，37(2):224.

［3］陸逸仙，張?jiān)罓N，等.腦部惡性腫瘤組織切片的紅外光譜研究［J］.中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，2000，8(4):278－279.

［4］石景森，王健生，等.膽囊癌組織的紅外光譜研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85(32):2287－2288.

［5］劉金緒，韓偉，等.關(guān)于宮頸癌變細(xì)胞紅外光譜測(cè)定方法的研究［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，1998，17(6):50－52.