刺槐、紅花刺槐、四倍體刺槐花粉體外萌發(fā)對比1)

戴 麗 孫 鵬 蔣晉豫 胡瑞陽 孫宇涵 袁存權(quán) 李 云

(林木育種國家工程實(shí)驗室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083)

刺槐(Robinia pseudoacaciaL)又名洋槐，屬于蝶形花科刺槐屬。原生于北美洲阿巴拉契亞山脈和奧薩克山脈一帶，17世紀(jì)初被引入歐洲，20世紀(jì)初引入我國［1］，分布區(qū)面積達(dá) 1 100 km×1 500 km，是當(dāng)今世上造林面積僅次于楊樹和桉樹的速生闊葉樹種［2－3］。刺槐生長迅速，木材堅韌，紋理細(xì)致，有彈性，耐水濕，抗腐朽，是重要的速生用材樹種。刺槐根系發(fā)達(dá)，具根瘤，有一定的抗旱、抗煙、耐鹽堿能力，是華北、西北等地區(qū)優(yōu)良的保持水土、防風(fēng)固沙、改良土壤和“四旁”綠化樹種［4］，刺槐的花粉可釀蜜［5］，枝葉可用作牲畜飼料及綠肥［6］，是優(yōu)良蜜源樹種和飼料樹種，深受群眾歡迎。

自從我國開展刺槐遺傳育種研究工作以來，主要進(jìn)行了刺槐速生良種選育、刺槐用材無性系選育和刺槐觀賞、飼用等專用品種選育，改良工作主要局限在優(yōu)良無性系選育及國外引進(jìn)新品種上［7］。在控制雜交育種方面涉及很少，而雜交育種是一種非常有效的增加變異的手段［8］。搞好刺槐的雜交育種工作，對于我國刺槐育種和新品種選育至關(guān)重要。授粉受精是雜交工作的基礎(chǔ)，花粉的萌發(fā)和生長是授粉受精的關(guān)鍵問題之一。特別是生長在不同區(qū)域，不同氣候條件下的刺槐，以及不同單株、無性系，甚至不同種的刺槐，常常表現(xiàn)花期不遇。有的還表現(xiàn)花粉活力低、不萌發(fā)、生長差、難以實(shí)現(xiàn)授粉受精，從而致使雜交失敗。同時花粉資源保存、跨地域開展雜交，以及不同優(yōu)株、不同種之間的雜交，都離不開花粉的保存和活力鑒定技術(shù)，綜上所述，能夠快速準(zhǔn)確測定刺槐花粉活力對于刺槐的雜交育種具有重要意義。

植物花粉生活力檢測的方法較多，如花粉染色測定法、氯化三苯基四氮唑染色法(TTC法)、I－KI染色法、聯(lián)苯胺法、熒光染色法、花粉離體萌發(fā)測定法，以及花粉授粉結(jié)實(shí)檢測法等，其中花粉離體萌發(fā)測定方法簡單、迅速、合理［9］。前人對于刺槐花粉活力的研究并不多，多數(shù)使用染色法，如田志和等［10］在研究刺槐開花結(jié)實(shí)生物學(xué)特性時使用亞甲基藍(lán)和蔗糖的混合溶液測定花粉的生活力，原法憲［11］使用的聯(lián)苯胺—甲萘酚染色的方法。在香花槐［12］和四倍體刺槐［13］花粉生活力的研究中使用TTC染色法。王念等［14］是唯一使用培養(yǎng)基法測定金葉刺槐和荷刺Ⅰ號花粉生活力的人，培養(yǎng)基使用15%蔗糖+0.001%硼酸。至于蔗糖、硼酸和Ca2+對于刺槐花粉萌發(fā)的影響還未見報道。蔗糖、硼酸和Ca2+作為花粉離體培養(yǎng)的基本組成成分在木槿［15］、百合［16］、小麥［17］、楊樹［18］等很多植物中均有應(yīng)用。但不同植物所需的質(zhì)量濃度范圍有一定的差異。本試驗以刺槐、紅花刺槐(R.pseudoacaciavar.decaisneanaCarr.)和四倍體刺槐(TetraploidR.pseudoacacia.L)的新鮮花粉為材料，采用正交設(shè)計，研究花粉的離體萌發(fā)最適培養(yǎng)基成分，其結(jié)果可為刺槐花粉生殖生物學(xué)研究、種質(zhì)資源保存、雜交育種提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

刺槐、紅花刺槐和四倍體刺槐的花藥和花粉材料分別采自北京市延慶縣米家堡林場的刺槐林基地、北京林業(yè)大學(xué)校園的紅花刺槐觀賞綠化樹，以及北京市延慶縣北張莊的四倍體刺槐基地。

在材料來源地的刺槐盛花期分別收集3種刺槐的花藥(b)和花粉(k)?；ㄋ幉杉贚(花冠)∶L(花萼)=5 ∶2(長度比)，且未散粉的時期(圖 1a、b、c)，花粉采集于小花剛剛開放時期。將收集到的花藥與花粉自然晾干一晝夜。將刺槐、紅花刺槐、四倍體刺槐開花散粉后直接采集的花粉分別記為刺槐k、紅花刺槐k、四倍體刺槐k;采集的花藥開裂后收集的花粉記為刺槐b、紅花刺槐b、四倍體刺槐b。將k和b兩種不同方式下收集的花粉均勻涂抹在培養(yǎng)基上，在(25±1)℃條件下培養(yǎng)6 h后用13395H2X徠卡顯微鏡觀察并照相，同時，測量不同培養(yǎng)基上花粉管生長長度，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)觀察3個視野。以花粉管長度超過花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，萌發(fā)率=(已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))×100%。

圖1 3種刺槐花外形及其花粉萌發(fā)

以2%瓊脂為基本培養(yǎng)基。采用L16(45)正交設(shè)計，研究蔗糖、硼酸、硝酸鈣3個因素的4個水平對刺槐花粉在不同花粉采集期的萌發(fā)和生長影響。試驗結(jié)果采用DPS 7.05進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對刺槐花粉萌發(fā)率的影響

蔗糖和硼酸是影響花粉萌發(fā)率的重要因素。蔗糖不僅為花粉萌發(fā)和花粉管生長提供營養(yǎng)，還有維持培養(yǎng)環(huán)境滲透壓的作用［19］。硼酸可增加花粉對糖的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)及代謝，增加氧的吸收，并促進(jìn)果膠物合成［19－20］。本試驗觀察發(fā)現(xiàn)，刺槐、紅花刺槐以及四倍體刺槐的花粉均在低質(zhì)量濃度(50 g·L－1)蔗糖的培養(yǎng)基上萌發(fā)率低，僅為1.6% ～23.5%，同時表現(xiàn)花粉壁和花粉管頂端破裂，釋放出其內(nèi)含物到培養(yǎng)基上(圖1d、e、f)，但當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度提高后(100～200 g·L－1)，該不良現(xiàn)象消失。在低蔗糖質(zhì)量濃度(50 g·L－1)不變的情況下，隨著硼和鈣質(zhì)量濃度的增加，花粉管伸長生長明顯，但其頂端膨大至破裂(圖1g、h、i)。從而看出，硼和鈣能夠促進(jìn)刺槐花粉管的伸長生長，但并不能提高培養(yǎng)基的滲透壓，花粉管仍然不能正常生長。此外，在本試驗所設(shè)置的蔗糖質(zhì)量濃度梯度50～200 g·L－1中，始終沒有發(fā)現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象。

表1不同培養(yǎng)基對刺槐花粉離體萌發(fā)影響的正交設(shè)計g·L－1

表2 不同培養(yǎng)基對刺槐萌發(fā)率影響的正交試驗極差分析%

從表2的各因素不同水平的萌發(fā)率可以找出每種花粉的最適培養(yǎng)基質(zhì)量濃度。刺槐b和k都為A3B4C2，萌發(fā)率分別為39.6%和68.2%(圖1k、l);紅花刺槐b:A4B3C1，紅花刺槐k:A4B4C1(萌發(fā)率為54.5%，圖1j);四倍體刺槐b:A4B2C2，四倍體刺槐k:A2B2C1。

表3 不同培養(yǎng)基對刺槐花粉花粉管長度影響的正交試驗分析 μm

2.2 花粉的不同采集時期與刺槐花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的關(guān)系

從表2和表4可以看出，除刺槐b之外，蔗糖的萌發(fā)率極差最大，說明蔗糖對3種刺槐不同時期的花粉萌發(fā)影響最大，方差分析也達(dá)到了顯著水平。除紅花刺槐k之外，硼酸對3種刺槐不同時期采集的花粉萌發(fā)影響次之，最后是硝酸鈣。說明蔗糖、硼酸和硝酸鈣對3種刺槐花粉萌發(fā)的影響大體相同，符合由大到小的順序為:蔗糖、硼酸、硝酸鈣的規(guī)律。對花粉萌發(fā)影響比較特殊的有:刺槐b由大到小的順序為:硼酸、蔗糖、硝酸鈣;紅花刺槐k由大到小的順序為:蔗糖、硝酸鈣、硼酸，這說明硼對刺槐天然散粉前采集的花粉離體萌發(fā)的影響大于蔗糖和硝酸鈣，而鈣離子對紅花刺槐天然散粉花粉體外萌發(fā)的影響大于硼離子。

刺槐和紅花刺槐天然散粉后的平均花粉萌發(fā)率(平均萌發(fā)率為所有組合平均值)明顯高于采集花藥后收集的平均花粉萌發(fā)率(普通刺槐b、k分別為13.8% 和 44.2%，紅花刺槐 b、k 分別為 11.6% 和30.9%)。說明二倍體刺槐在天然散粉前的一段時間內(nèi)還在進(jìn)行最后的成熟生長，這一段時間對于二倍體刺槐生殖生長很重要，影響花粉后期能否正常萌發(fā)。同二倍體刺槐相比，四倍體刺槐兩種花粉的平均萌發(fā)率相差不多(四倍體刺槐b、k分別為:8.6%和9.3%)，可見四倍體刺槐天然散粉前就已經(jīng)達(dá)到成熟，但萌發(fā)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于二倍體，表現(xiàn)為花粉粒大，花粉活性差。

2.3 不同培養(yǎng)基對刺槐花粉管伸長生長的影響

花粉的萌發(fā)與花粉管的伸長生長是一個復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過程，許多研究表明硼和鈣參與了花粉管的伸長生長，并且該體系已被越來越多地用作研究細(xì)胞生長的分子調(diào)控機(jī)理，近年來的許多研究結(jié)果證明細(xì)胞外的鈣離子參與了這一過程［21－22］。離體生長的花粉管需要不斷地從外界吸收Ca2+，以維持花粉管頂端的Ca2+梯度分布，為其極性生長創(chuàng)造條件［23］。木槿中也證實(shí)在有鈣和無鈣加入的情況下，有鈣明顯比無鈣條件下花粉管伸長快，且增加的幅度也很明顯［15］。硼與鈣在花粉萌發(fā)過程中有著密不可分的關(guān)系，硼處理的百合花粉細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子質(zhì)量濃度明顯高于無硼處理的質(zhì)量濃度，并且細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子變化屬于劑量依賴型，即依賴于培養(yǎng)基中的硼酸質(zhì)量濃度，隨硼酸質(zhì)量濃度升高而升高，但過高質(zhì)量濃度的鈣和硼又會抑制花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長生長［16］。

為了找出最適硼酸和硝酸鈣質(zhì)量濃度，花粉培養(yǎng)6 h后測量花粉管長度，并進(jìn)行分析。從表3和表4可以看出，蔗糖對紅花刺槐和四倍體刺槐花粉管的伸長影響最大，對于刺槐花粉管的伸長影響不如硼酸大。硼酸對刺槐和紅花刺槐的影響大于硝酸鈣，而在四倍體刺槐花粉管生長過程中，硝酸鈣的影響大于硼酸，這就說明即使同一樹種，不同花色與不同倍性之間的生長過程中所需營養(yǎng)元素的量有所差異。從各水平的平均值得出3種刺槐的花粉管生長最適培養(yǎng)基，普通刺槐b、k:A2B4C3，花粉管長度分別達(dá)347 μm 和 330 μm(圖 1m、n);紅花刺槐 b:A2B3C3，紅花刺槐 k:A2B3C2;四倍體刺槐 b:A4B3C2，花粉管長度達(dá)206 μm(圖1o)，四倍體刺槐k:A4B3C3。從最優(yōu)組合可看出，刺槐所需硼酸質(zhì)量濃度最高，四倍體刺槐所需蔗糖質(zhì)量濃度最高，且每個因素對花粉管的影響都與對花粉萌發(fā)率的影響不同。但紅花刺槐和四倍體刺槐各水平之間沒有達(dá)到顯著性差異，刺槐的各水平之間達(dá)到顯著性差異。由多重比較可看出，刺槐b和k的蔗糖質(zhì)量濃度A1、A3、A4之間無顯著差異，A2水平顯著高于前3個水平，且在顯微鏡下觀察，其花粉管細(xì)長，無破裂扭曲現(xiàn)象。

表4 正交設(shè)計方差分析

3 結(jié)論與討論

豆科植物具有閉花授粉的習(xí)性，在開花前已經(jīng)散粉，所以研究散粉前的花粉活力對于選擇去雄時間有一定的參考價值。在菜豆的開花習(xí)性研究中得出菜豆在花器居中時花粉生活力最大，結(jié)合菜豆閉花授粉的特性，應(yīng)在花器更小時選擇雜交親本［24］。試驗結(jié)果表明3種刺槐在天然散粉前的花粉活力低，最高平均萌發(fā)率為13.8%，此時花器發(fā)育達(dá)到最大且未散粉，便于操作，因此，可以考慮將此時作為去雄時間。

目前的許多研究認(rèn)為，在植物的開花期內(nèi)，盛花期采集的花粉生活力較好。如廣東荔枝同一品種一般盛花期比初、末花期的花粉生活力強(qiáng)［25］。沙棘盛花期花粉的生活力明顯高于初花期花粉［26］。葡萄4個不同發(fā)育時期中，開花盛期有生活力花粉的比率最高［27］。在本試驗中，刺槐和紅花刺槐的花粉活力表現(xiàn)同前人研究結(jié)果相同，開花后采集的花粉萌發(fā)率明顯高于開花前采集的花粉萌發(fā)率，然而，四倍體刺槐開花前后2種花粉的平均萌發(fā)率相差不多，這可能是因為染色體組加倍以后加速了花粉成熟。

染色體組加倍以后大大降低了四倍體刺槐花粉的活力。四倍體刺槐屬于同源多倍體，染色體成倍數(shù)性增加，4條同源染色體可能發(fā)生不聯(lián)會和四價體提早解離的情況。這使得孢子母細(xì)胞在減數(shù)分裂時形成多種不同組合的分離方式，在后期Ⅰ分離時可能是2/2式均衡分離，也可能是3/1或2/1或1/1式不均衡分離。相對于未加倍的刺槐和紅花刺槐而言，四倍體刺槐染色體的不正常分離造成花粉活力降低?；ǚ刍盍Φ蛯λ谋扼w刺槐與刺槐之間的雜交造成了一定的困難。

本試驗研究了蔗糖、硼酸、硝酸鈣對花粉體外萌發(fā)及花粉管生長的影響。綜上可知，3個因素在花粉萌發(fā)過程中起著不同的作用，在自然條件下，花粉在柱頭上生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)及礦物質(zhì)元素是由柱頭和花柱來補(bǔ)償?shù)?。在花粉離體培養(yǎng)中，不同植物種類所需的蔗糖、硼酸、硝酸鈣的質(zhì)量濃度有所不同。例如，金光杏梅［19］最適蔗糖質(zhì)量濃度為20 g·L－1，最適硼酸質(zhì)量濃度為 3 g·L－1;小黑楊［18］的最適蔗糖質(zhì)量濃度為150 g·L－1，最適硼酸質(zhì)量濃度為0.02 g·L－1。即使是同一個種的不同品種也有不同的最適蔗糖質(zhì)量濃度，如菜豆［24］中的早油豆王、園豐907、油豆王等8個品種的最適質(zhì)量濃度均在10%左右，油豆和白花菜豆為15%左右，紅花菜豆則在5%左右。研究結(jié)果表明，刺槐和紅花刺槐b的最適蔗糖質(zhì)量濃度為15 g·L－1，紅花刺槐k和四倍體刺槐b的最適蔗糖質(zhì)量濃度為20 g·L－1，四倍體刺槐k的最適蔗糖質(zhì)量濃度為10 g·L－1，從而可知刺槐散粉前后的花粉萌發(fā)所需蔗糖質(zhì)量濃度不變，紅花刺槐散粉后比散粉前的花粉萌發(fā)所需蔗糖質(zhì)量濃度高，四倍體刺槐散粉后比散粉前的花粉萌發(fā)所需蔗糖質(zhì)量濃度低。硼酸和硝酸鈣的最適質(zhì)量濃度也因不同種和不同的采集時間而有所不同，總結(jié)得出3種刺槐花粉萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基，刺槐b和k 都為蔗糖0.15 kg·L－1+硼酸20.00 mg·L－1+硝酸鈣 0.50m g·L－1;紅花刺槐 b:蔗糖0.20k g·L－1+硼酸 15.00 mg·L－1，紅花刺槐 k:蔗糖 0.20 kg·L－1+硼酸 20.00 mg·L－1;四倍體刺槐 b:蔗糖 0.20 kg·L－1+硼酸 10.00 mg·L－1+硝酸鈣 0.50 mg·L－1，四倍體刺槐 k:蔗糖 0.10 kg·L－1+硼酸 10.00 mg·L－1。其中蔗糖對3種刺槐的花粉萌發(fā)的影響最大，其次是硼酸，最后是硝酸鈣。從不同花粉最適培養(yǎng)基對比可以看出，紅花刺槐花粉萌發(fā)可以沒有外源鈣的參與，刺槐和四倍體刺槐對外源鈣的質(zhì)量濃度要求也不高，說明刺槐花粉內(nèi)部的鈣庫足以支持花粉的正常萌發(fā)，而在花粉管的生長過程中，有鈣比無鈣培養(yǎng)基的花粉管生長要快。

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