DM120方對糖尿病大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)的影響*

楊雪蓉 姚 政 陶 楓 徐佩英 顧逸夢 徐雋斐 沈遠(yuǎn)東 陸 灝△

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

糖尿病腎?。―N）是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率約占糖尿患者的35%～40%，患者一旦出現(xiàn)微量蛋白尿，其腎功能將不可逆轉(zhuǎn)地進(jìn)行性下降，直至出現(xiàn)終末期腎功能衰竭。本實(shí)驗(yàn)通過觀察中藥復(fù)方DM120方對高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）蛋白表達(dá)的影響及形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，探討其對糖尿病腎臟病變的保護(hù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量80～120 g，清潔級，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。自由飲水，不限制活動，每日光照時間12 h，環(huán)境溫度控制在18～28℃之間。

1.2 藥物與試劑 DM120方（黃芪、葛根、生地黃、丹參），藥物購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上藥用蒸餾水浸沒約120min，然后再加數(shù)倍蒸餾水，持續(xù)煮沸約30 min。取過濾液，再次加適量蒸餾水煮沸，持續(xù)約30 min，合并兩次濾液并濃縮至2000 mL。分次將濾液離心，2500 r/min，30 min，合并上清液，再次煮沸30 min，將煎劑濃度調(diào)整至每毫升濃縮液含生藥3 g，4℃冰箱保存。STZ美國Sigma公司生產(chǎn)。高脂飼料由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供，配方為100 kg中含73 kg基礎(chǔ)飼料，20 kg豬油，4 kg白糖，2 kg全脂奶粉，1 kg膽固醇；脂肪約占總能量比的36%。24 h尿微量白蛋白（U-Alb），試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體，由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 儀器 羅氏Advantage快速血糖儀；ASP300自動脫水機(jī)、G1160石蠟包埋機(jī)、RM2235切片機(jī)、HI1220烤片機(jī)，德國LEICA公司；臺式冷凍離心機(jī)：ABI-7300（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司，Z-216MK（HERMLE）；全自動生化分析儀：Unical Dx600 Synchron clinical system。

1.4 模型建立 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，喂養(yǎng)高脂飼料和基礎(chǔ)飼料的混合料，2周后改為完全高脂飼料。喂養(yǎng)6周后，隨機(jī)取30只由腹腔注射STZ 30 mg/kg，另10只腹腔注射緩沖液，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，4周后斷尾采血測血糖，在造模的30只中選血糖異常者（血糖>16.7 mmol/L）繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料2周，復(fù)核血糖后隨機(jī)取20只進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.5 分組及給藥 將模型大鼠分別置于代謝籠內(nèi)留取24 h尿液，測定24 h U-Alb，然后按24 h U-Alb排泄量分為模型組、DM120方組。未造模者作為正常組。整個實(shí)驗(yàn)期間，所有大鼠均給予基礎(chǔ)飼料。DM120方組給予DM120煎劑按0.5 mL/100 g體質(zhì)量 （相當(dāng)于生藥15 g/kg體質(zhì)量）灌胃；模型組給予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃；正常組：基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，不做其他處理。每日1次，連續(xù)8周。每周記錄大鼠生長情況1次。

1.6 標(biāo)本采集與處理 于第8周末，再次分別置代謝籠內(nèi)留取24 h尿液，計量后離心，去除沉渣，-20℃保存，采用ELISA法測定24hU-Alb。末次給藥后禁食12h，用3%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，取主動脈采血5 mL，采血樣本分離血清，檢測血糖（BG）、肌 酐 （SCr）、尿 素 氮 （BUN）、膽 固 醇 （TC）、三 酰 甘 油（TG）。取腎皮質(zhì)，組織塊厚約2 mm，10%中性甲醛固定24 h，脫水后浸蠟，石蠟包埋，制成4 μm厚度的切片。免疫組化檢測：取石蠟切片，脫蠟、水化，用3%H2O2室溫15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)聯(lián)合復(fù)合蛋白酶修復(fù)暴露抗原，加封閉蛋白，室溫5 min滴加一抗和生物素化二抗，DAB顯色，蘇木精覆蓋切片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，每張切片在400倍鏡下取不重疊的兩個視野，測量陽性染色區(qū)域的總面積和累積光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用（±s）表示，各組均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠 SCr、BUN、24 h U－Alb比較 見表1。 治療 8周后，正常組大鼠無死亡，模型組大鼠死亡1只，DM120方組大鼠死亡2只。模型組大鼠SCr、BUN、24 h U-Alb水平均較正常組明顯升高（P＜0.01）；而 DM120方治療組大鼠 SCr、BUN水平均較模型組下降（P＜0.05），24 h U-Alb水平較模型組明顯下降（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組大鼠 SCr、BUN、24 h U-Alb 比較（±s）

表1 各組大鼠 SCr、BUN、24 h U-Alb 比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 BUN（mmol/L） 24 h U-Alb（μg/24 h）正常組 5.90±1.96 7.54±1.52 9 45.25±7.96**DM120 方組 8 37.38±7.42△ 7.38±1.72△ 8.99±0.93△△n SCr（mmol/L）10 33.13±6.33模型組 9.65±2.52** 16.53±1.22**

2.2 各組大鼠BG、血脂水平比較 見表2。模型組大鼠BG水平較正常組明顯升高（P＜0.01），TG有一定程度的升高，TC變化不顯著；而DM120方組大鼠BG較模型組下降（P＜0.05），TG較模型組明顯下降（P＜0.01）。

表2 各組大鼠 BG、TC、TG 水平比較（mmol/L，±s）

表2 各組大鼠 BG、TC、TG 水平比較（mmol/L，±s）

9 21.54±2.27**DM120 方組 8 18.40±4.14△ 2.46±0.75 0.84±0.21△△BG 10 6.25±0.49模型組 2.67±0.59 1.29±0.42組 別 TC TG正常組 2.69±0.58 1.18±0.19 n

2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)觀察 見圖1。模型組腎小球肥大，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)增生明顯，腎小球基底膜增厚，毛細(xì)血管腔瘤樣擴(kuò)張，可見腎小管萎縮和擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞空泡變型，管型形成，小管間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤。DM120方組有類似改變，但病變程度較輕。

2.4 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá) 見圖2、表3。顯示，TGF-β1陽性反應(yīng)為腎小球或腎小管胞質(zhì)出現(xiàn)褐色或棕黃色顆粒沉淀。模型組顯色濃重，TGF-β1表達(dá)最強(qiáng)，DM120方組顯色范圍較模型組局限，顯色較輕淺，TGF-β1表達(dá)較輕。經(jīng)對大鼠腎組織免疫組化積分光密度測定表明，與正常組比較，模型組顯著高于正常組（P＜0.01）；DM120 方組較模型組顯著下降（P＜0.01）。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1積分光密度比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1積分光密度比較（±s）

組 別 n 積分光密度正常組 20 3729.05±2530.49模型組 20 17639.52±5982.20**DM120 方組 20 8392.86±3982.03△△

3 討 論

DN的特征性病理改變是腎基底膜增厚和系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚，導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化。隨著研究的不斷深入，TGF-β1已被公認(rèn)為是最強(qiáng)的致纖維化因子，其可調(diào)節(jié)ECM代謝，抑制多種腎臟細(xì)胞的生長、凋亡和分化。腎小球和腎小管上皮細(xì)胞均可以分泌TGF-β1，在糖尿病早期患者的腎小球中即有TGF-β1表達(dá)增多，其后貫穿整個發(fā)病過程并隨病程呈漸進(jìn)性升高［1］。TGF-β1可破壞足細(xì)胞，損傷濾過膜，導(dǎo)致腎小球屏障功能受損［2］。TGF-β1表達(dá)升高，腎小球系膜擴(kuò)張和基底膜增厚，刺激Ⅳ型膠原等ECM組分合成增加，導(dǎo)致腎小球功能障礙，加重腎臟病變；同時通過調(diào)節(jié)腎臟基質(zhì)降解酶體系，影響腎小球ECM的局部沉積，促進(jìn)腎臟纖維化［3-5］。既往研究表明，TGF-β1是高糖狀態(tài)下腎臟巨噬細(xì)胞激活后的炎性產(chǎn)物，是糖尿病重要的細(xì)胞因子。高糖狀態(tài)下，腎小球固有細(xì)胞PKC信號通路被激活，使MAPK活性增加，激活腎內(nèi)TGF-β/Smad信號通路，促進(jìn)纖維連接蛋白啟動基因活性的過度表達(dá)，從而使周圍血管通透性增加，基質(zhì)沉積，導(dǎo)致腎臟纖維化［6-7］。本實(shí)驗(yàn)中，DM120方可明顯下調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)，這可能是其改善尿微量白蛋白排泄量、治療DN的機(jī)制之一。

DN 屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”、“尿濁”、“虛勞”、“水腫”、“關(guān)格”等范疇。歷代醫(yī)家認(rèn)為，本病多由于消渴日久、遷延不愈而并發(fā)?，F(xiàn)今許多醫(yī)家認(rèn)為本病的基本病機(jī)是氣陰兩虛，其他均為氣陰兩虛之變證。病之初期以陰傷為主，遷延日久，陰傷及氣，臨床多表現(xiàn)為氣陰兩虛之證，且以腎臟氣陰兩虛最為突出，瘀血為主要兼夾之邪，常貫穿于病理始終。此所謂腎水不足，肝木失養(yǎng)，肝腎陰虛，陰虛陽亢，腎元封藏?zé)o權(quán)，陰虛耗氣，氣陰兩傷，腎氣不固，精微外泄。陰虛火旺煎熬津液，氣虛運(yùn)血無力，瘀血阻于腎絡(luò)。病勢纏綿，久病必瘀，久病入絡(luò)，故有瘀血阻滯之標(biāo)實(shí)。故治療當(dāng)以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為要，DM120方正是宗此治療大法而創(chuàng)立的組方，經(jīng)過臨床反復(fù)實(shí)踐，療效確切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，DM120方能夠改善腎小球肥大，減輕腎臟病理損害，保護(hù)腎功能，推測其機(jī)制可能與降低TGF-β1表達(dá)有關(guān)，從而改善腎臟組織的纖維化，對DN有一定的保護(hù)作用。

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