舒郁散對慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為及海馬BDNF表達(dá)的影響*

陳利平 王發(fā)渭 孫志高 黃泉智 柯清林

（1.解放軍總醫(yī)院海南分院，海南 三亞 572004；2.解放軍總醫(yī)院學(xué)員隊，北京 100853）

舒郁散具有抗抑郁作用，可調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽以及海馬5-HT受體表達(dá)而發(fā)揮抗抑郁作用［1-2］。本研究選用慢性不可預(yù)見的應(yīng)激抑郁模型，觀察舒郁散對模型大鼠行為的影響，以及對海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）蛋白表達(dá)的影響，以期為抑郁癥的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 60只Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物號為SCXK-京-2009-0007。大鼠先用Open-Field法作行為學(xué)評分［3］，選擇得分相近的50只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、百憂解組（20 mg/次）、舒郁散小劑量組（含生藥0.5 g/mL）、舒郁散大劑量組（含生藥5.0 g/mL），每組10只。正常對照組每籠飼養(yǎng)5只，其他組每籠飼養(yǎng)1只。

1.2 藥物與試劑 舒郁散處方由中國人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科提供，由柴胡、棗仁、郁金、梔子等組成，上藥浸泡、煎煮，過濾，于80℃恒溫水浴中濃縮成含生藥量5 g/mL藥液，存冰箱備用，使用時蒸餾水稀釋灌胃；百憂解膠囊，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字2006017。BDNF（批號：909083W）北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。二抗顯色試劑盒為En Vision Detection Kit基因科技 （上海）有限公司產(chǎn)品（Code No：GK500705）。全自動真空脫水機（LEICAASP300）、組織包埋機（LEICAEG1140H）、石蠟切片機（LEICARM2135）、展片機（LEIC-AHI1210）均為德國LEICA公司產(chǎn)品。光學(xué)顯微鏡為日本OLYMPUSBX60顯微鏡。APES防脫玻片、PBS緩沖液、檸檬酸鹽緩沖鹽、3%H2O2為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 模型制備 對大鼠進(jìn)行21 d應(yīng)激刺激，包括：搖晃5 min，禁水 24 h、禁食 24 h、夾尾 1 min，電擊足底（每次 10 s，間隔1 min），冰水游泳 5 min，噪音刺激、轉(zhuǎn)換晝夜節(jié)律 24 h，制動，熱刺激40℃ 5 min。連續(xù)造模和給藥21 d，每日上午給藥，下午給予相應(yīng)刺激［4］，制得慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁大鼠模型。

1.4 糖水消耗實驗 在造模前1日及造模第22日進(jìn)行糖水消耗實驗。實驗時所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，每只大鼠加1%蔗糖溶液100 mL，同時所有大鼠進(jìn)行禁食，計算大鼠4 h飲用1%蔗糖溶液的量。

1.5 強迫游泳測試 強迫游泳試驗在慢性應(yīng)激3周后進(jìn)行（9：30至11：30），把大鼠放在一個盛有高40 cm水（溫度24～26℃）的透明玻璃容器（高25 cm，直徑14 cm）被迫游泳。每只大鼠單獨測試，按照預(yù)先設(shè)計順序安排各組進(jìn)行游泳測試，保證各組間測試時間無偏倚。在每次測試（6 min）中，記錄后4 min大鼠的不動時間。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 參照《大鼠腦立體定位圖譜》［5］對大鼠海馬組織取材，常規(guī)脫水，浸蠟包埋，切片撈于APES防脫玻片上，60℃烤片4 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，過梯度酒精，PBS（0.01 mol/L pH 7.2-7.4） 浸洗 2 min×3，3%H2O210 min，PBS 浸洗 2 min×3，浸入檸檬酸鹽緩沖液（0.01 mol/L pH6.0）微波熱修復(fù)后，滴加一抗 BDNF（濃度為 1∶300），陰性對照組加 0.01 mol／L PBS 代替一抗，4℃冰箱孵育過夜，室溫復(fù)溫30 min后PBS浸洗5 min×3后滴加非生物素二抗，濕盒中室溫30 min，PBS浸洗5 min×3，DAB顯色光鏡下控制時間，常規(guī)脫水，透明，封片。采用Imageproplus5.1圖像分析系統(tǒng)測定每張照片的平均光密度值，每張切片同一部位取五個不同的視野。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以（±s）表示，主要統(tǒng)計學(xué)方法采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠糖水消耗量及強迫游泳不動時間比較 見表1。與正常對照組相比，模型組大鼠糖水消耗量、強迫游泳不動時間顯著減低（P＜0.01）；大劑量舒郁散、百憂解能明顯增加抑郁大鼠糖水消耗量，與模型組比，有顯著差異（P＜0.05）。大劑量舒郁散能明顯縮短抑郁大鼠游泳不動時間，與模型組比，有顯著差異（P＜0.05）；百憂解也能明顯縮短大鼠游泳不動時間，與模型組比有顯著差異（P＜0.05）。

表1 各組大鼠糖水消耗量及強迫游泳不動時間比較（±s）

表1 各組大鼠糖水消耗量及強迫游泳不動時間比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

第1日 第22日正常對照組 10 87.74±16.48 88.23±15.42 104.34±16.37模型組 10 85.44±17.16 58.37±12.64*174.26±27.62*百憂解組 10 89.71±15.26 79.46±17.37△ 121.14±21.45△舒郁散大劑量組 10 86.38±16.72 82.87±16.68△ 118.31±19.52△舒郁散小劑量組 10 90.21±14.28 72.62±15.14 146.73±18.66組 別 n 糖水消耗量 強迫游泳不動時間

2.2 各組大鼠海馬BDNF陽性表達(dá)平均光密度值比較 見表2。光鏡下可見BDNF的陽性細(xì)胞主要集中于海馬CA1和CA3區(qū)錐體細(xì)胞和DG顆粒細(xì)胞層。陽性表達(dá)位于海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞胞漿中，正常對照組大鼠海馬神經(jīng)元核呈圓形，大而清晰、核仁明顯、排列整齊；模型組海馬中BDNF陽性表達(dá)較正常對照組面積小，胞漿著色淺，平均光密度值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。舒郁散大劑量組、百憂解組大鼠海馬BDNF陽性細(xì)胞表達(dá)比模型組面積更大、顏色更深，兩組平均光密度值與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。舒郁散小劑量組陽性表達(dá)雖有增強，與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組大鼠海馬BDNF陽性表達(dá)平均光密度值比較（±s）

表2 各組大鼠海馬BDNF陽性表達(dá)平均光密度值比較（±s）

組 別 n BDNF正常對照組 10 187.28±65.67模型組 10 102.45±47.75*百憂解組 10 168.17±55.38△舒郁散大劑量組 10 173.42±58.74△舒郁散小劑量組 10 156.23±51.49

3 討 論

本課題通過采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型，該模型可模擬抑郁癥的核心癥狀，即興趣喪失、快感缺乏、運動能力、探索行為能力及性行為能力等下降；其抑郁狀態(tài)持續(xù)時間長符合實驗研究要求。當(dāng)前國外許多學(xué)者采取液體消耗實驗中糖水的消耗量和糖水偏愛百分比作為測量快感缺乏的有效指標(biāo)［6］。行為學(xué)實驗在篩選具有抗抑郁活性的藥物方面發(fā)揮著重要的作用。實驗研究中，造模后大鼠糖水消耗量降低，說明模型組動物活動減少、興趣喪失、食欲減退，而百憂解及舒郁散大劑量可增加慢性應(yīng)激抑郁大鼠糖水的消耗量。通過觀察動物在不可逃避性應(yīng)激狀態(tài)下，因絕望致不動時間的改變可反映藥物的抗抑郁效應(yīng)，強迫游泳實驗是常用的絕望動物方法［7］，大劑量舒郁散能明顯增加抑郁大鼠糖水消耗量以及強迫游泳不動時間，具有抗抑郁的作用。

BDNF的表達(dá)增加有利于促進(jìn)神經(jīng)元存活、生長和分化成熟，上調(diào)海馬突觸可塑性，被認(rèn)為可能是各種抗抑郁劑治療的共同作用機制［8］。BDNF主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)大腦內(nèi)，以海馬、皮質(zhì)、屏狀核等腦區(qū)的分布為高，研究表明BDNF對膽堿能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、運動神經(jīng)元、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的存活和生長，對延緩神經(jīng)元的變性和自然死亡，均具有很好的生物活性作用；研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者海馬部位及前額葉皮層部位BDNF水平明顯減少［9］。本實驗研究結(jié)果顯示：經(jīng)過21 d慢性應(yīng)激刺激后模型組大鼠海馬組織的BDNF的陽性表達(dá)降低與正常對照組比較差異顯著；中藥大劑量舒郁散和百憂解組夠顯著提高海馬組織BDNF的陽性表達(dá)，這提示舒郁散抗抑郁的藥理可能是通過提高海馬組織BDNF的表達(dá)來起作用。本實驗結(jié)果與Taliaz［10］文獻(xiàn)報道相似。

抑郁癥屬于中醫(yī)學(xué)“郁證”，其發(fā)病大多是由情志所傷，肝失疏泄，肝氣郁結(jié)，氣機不和所致，病變部位初期在肝，隨著肝郁氣滯、氣機失和，日久則傷及心、脾二臟，或為心火，或肝郁犯脾。因此，治療抑郁癥實證以疏肝理氣解郁為主，虛證宜養(yǎng)心健脾安神。本研究采用具有疏肝理氣、養(yǎng)心解郁功效的中藥舒郁散治療，結(jié)果表明大劑量舒郁散可以改善慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為，其作用可能與增加海馬BDNF蛋白表達(dá)有關(guān)，上述作用與其劑量呈正相關(guān)。舒郁散具有調(diào)理心肝、疏肝理氣、養(yǎng)心解郁之功效，本方對治療抑郁癥具有較好的療效，其他文獻(xiàn)也有報道［11-12］。本研究僅觀察舒郁散對慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為、海馬BDNF蛋白表達(dá)變化進(jìn)行研究，抑郁證的發(fā)病機理較為復(fù)雜，有關(guān)舒郁散的作用機理還有待于進(jìn)一步的研究。

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