瘤胃纖維降解菌株的篩選

朱繼紅，孫滿吉，張永根

（東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

瘤胃作為一個龐大的微生物資源庫，存在著大量的細菌、真菌及原蟲，還有少量的噬菌體。經過長期的適應和選擇，微生物和宿主之間、微生物與微生物之間處于一種相互依賴、相互制約的動態(tài)平衡系統(tǒng)中。瘤胃中50%的纖維素消化，宏觀認為是瘤胃細菌、真菌和原蟲共同作用的結果，而在這一消化過程中，80%由細菌完成，主要是由于細菌數(shù)量及代謝產物多樣性的絕對優(yōu)勢[1-2]。外國對瘤胃細菌及真菌的分離已經取得較多成果，目前已經分離出200多個微生物種類[3]。我國關于瘤胃微生物分離的研究較少，目前報道的僅有張曉華從瘤胃內容物中分離得到1株瘤胃梭菌，彭海宏分離得到1株真菌，劉玉承在瘤胃內容物中分離出7株濾紙降解能力顯著的細菌，王平篩選出1株產纖維素酶活較高的米曲霉菌[3-6]。瘤胃微生物的研究已成為反芻動物研究的重點之一，本試驗以稻草秸稈為唯一碳源，選擇對稻草秸稈利用效果較好的菌株，通過測定菌株的纖維素酶活及對稻草秸稈的降解率，擬篩選一株瘤胃纖維降解菌。

1 試驗材料

1.1 瘤胃液的采集

選用裝有永久性瘺管的健康瘺管牛，自由飲水，在正常采食后，使用自制負壓取樣器于瘤胃內不同部位采集瘤胃液，過濾，通入CO2，于37℃保存迅速送回實驗室，備用。

1.2 稻草秸稈

稻草秸稈為收獲水稻后的優(yōu)質，無霉變的稻草秸稈，烘干后粉碎（40～60目），備用。

1.3 培養(yǎng)基

選擇性初篩固體培養(yǎng)基：KH2PO41.00 g、Mg?SO40.3 g、NaCl 0.1 g、NaNO32.5 g、CaCl2·6H2O 0.1 g、FeCl30.01 g、稻草粉20 g、pH自然；CMC-Na分離培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g、Na2HPO42.5 g、KH2PO41.5 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂20 g、pH 7.0～7.5；纖維素-剛果紅鑒別培養(yǎng)基[7]：（NH4）2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 K2HPO4l.0 g、 NaCl 0.5 g、 CMC-Na 2.0 g、剛果紅0.4 g、瓊脂20 g、pH 7.0；種子培養(yǎng)基（PDA）：可溶性淀粉6 g，葡萄糖20 g，酵母粉2 g，蛋白胨 5 g，KH2PO42 g，MgSO40.3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL；固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草秸稈粉、玉米粉、豆粕粉、麩皮按比例混勻，固液比為1∶1.5。

1.4 主要儀器設備

生物凈化工作臺DL-CJ-ZND型，由北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司生產；全溫度恒溫度氣浴搖床HZQ-C型，由哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司生產；立式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-30SI型，由南京萊布公司生產。

2 試驗方法

2.1 菌株初篩

在無菌狀態(tài)下取瘤胃液用生理鹽水進行不同梯度的稀釋。選取其中的3個稀釋梯度各0.1 mL，涂布于選擇性初篩平板培養(yǎng)基上，每個稀釋度3個重復，置于37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)24～48 h后，進行觀察分離。

2.2 菌株純化

用無菌接種環(huán)挑取單個菌落，用無菌生理鹽水稀釋，接種于CMC-Na分離培養(yǎng)基上，進行單菌落培養(yǎng)，反復多次，直至平皿中菌落形態(tài)完全一致，鏡檢后，置于4℃冰箱保存。

2.3 菌株鑒別

將純化菌株用生理鹽水稀釋接種于剛果紅鑒別培養(yǎng)基上，置于37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)72 h，用1 moL·L-1NaCl溶液脫色20 min，在菌落周圍有透明圈產生證明該菌種產纖維素酶。用游標卡尺分別測量透明圈直徑和菌落直徑，根據(jù)透明圈直徑/相應菌落直徑初步確定產纖維素酶較高的菌株。

2.4 固體發(fā)酵復篩

將混勻的固體發(fā)酵培養(yǎng)基定量地裝入500 mL的三角瓶中，高壓滅菌后冷卻，將種子培養(yǎng)基上生長良好的菌落用無菌生理鹽水沖洗制成孢子懸浮液，按10%的比例接種，混勻，置于37℃恒溫箱內培養(yǎng)5 d，取樣測酶活。對照組加入10%的無菌生理鹽水。

2.5 纖維素酶活的測定

纖維素酶活的測定參照Bowman等方法[8]。本試驗酶活性的測定方法為DNS法。

2.5.1 粗酶夜的制備

取固體發(fā)酵物4.0 g，加入生理鹽水46 mL浸泡2 h后，13000 rpm離心5 min，取上清液作為粗酶液。

2.5.2 葡萄糖標準曲線的制作

準確稱取于105℃烘干的無水葡萄糖1.00 g，配成濃度為1mg·mL-1的葡萄糖溶液，再分別配成濃度為0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、0.8、0.9、1.0mg·mL-1的標準溶液，吸取葡萄糖溶液1.0 mL于15 mL刻度試管中，然后加入DNS 2.0 mL溶液，混勻，用保鮮膜封口后，煮沸5 min，流水冷卻5 min，用蒸餾水定容至10 mL，混勻后在紫外分光光度計上于530 nm處比色，繪制葡萄糖標準曲線，見附圖。

附圖 葡萄糖標準曲線

2.5.3 羧甲基纖維素酶活性的測定

取15 mL的刻度試管4支，每支試管中加入1.0%羧甲基纖維素鈉1 mL，加入0.05 mol·L-1、pH 6.0磷酸鹽緩沖液1 mL。1號試管為酶樣空白，2、3、4號試管為酶樣平行樣。50℃水浴震蕩30 min，1號管加入磷酸鹽緩沖液0.5 mL，2、3、4號試管各加入酶液0.5 mL，50℃下水浴震蕩培養(yǎng)60 min（精確）。培養(yǎng)后4支試管立即加入DNS溶液2 mL，保鮮膜封口，渦旋混勻后在開水浴中煮沸5 min，取出后用循環(huán)水冷卻5 min，用蒸餾水定容至10 mL。以1號管為空白，在紫外分光光度計上于530 nm波長處進行比色。

2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0的ANOVA進行統(tǒng)計分析，結果以“平均值±標準誤”表示。

3 結果與分析

3.1 初篩結果

經以稻草秸稈為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基初篩、分離得到19株菌，分別編號為R1～R19。經纖維素剛果紅鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察不同菌株在培養(yǎng)基上的透明圈直徑/菌株直徑大小，篩選出7株產酶活性較好的菌株，瘤胃纖維降解菌初篩結果見表1。

表1 瘤胃纖維降解菌初篩結果

由表1可知，編號為R5、R3菌株產酶所形成的水解圈直徑（R）與菌落直徑（r）的比值較大，分別為6.64、6.27，表明該菌具有較高的產酶能力并且酶活力較強，并且具有較強的繁殖能力和分解羧甲基纖維素的能力。

3.2 復篩結果

將初篩出的7株菌用于固體發(fā)酵進行復篩。在發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵秸稈制備粗酶液測其羧甲基纖維素酶活和DM消失率，測定結果見表2。

由表2可知，無論是酶活大小還是DM消失率，R3均優(yōu)于其他6株菌。

表2 瘤胃纖維降解菌液體發(fā)酵結果

4 討論

4.1 纖維素降解菌的初篩

在平板降解圈分離纖維降解菌的諸多方法中，有的受底物來源的限制，有的靈敏度低，需培養(yǎng)較長時間，有的則因殺死菌體而需用影印移植，對分離工作造成諸多不便。而剛果紅法則無上述缺點，且對菌體無任何不良影響、靈敏度高、產生的透明圈清晰、易辨認?；谝陨咸攸c，剛果紅法成為分離纖維降解菌最直觀、最快捷的方法。有研究者認為，對數(shù)酶濃度同剛果紅染色水解圈存在線性關系，產酶越多，透明圈越大，產酶越快，透明圈出現(xiàn)越早。此法除可用于識別產纖維素酶的菌株，還可用于初步判定酶活性高低。本試驗通過纖維素酶法篩選出可產纖維素酶的菌株19株，確定透明斑直徑/菌落直徑較大的7株菌作為復篩對象。然而，有研究認為，透明圈的大小可以直接反映產酶濃度的高低，但不能完全代表菌株產酶能力。其原因主要為固體和液體培養(yǎng)基條件的不同；不同菌株的生長及產酶速度均不同；菌落大小及在平板上堆積情況的不同等都會造成透明圈大小不同，所以固體發(fā)酵復選必不可少。

4.2 纖維素酶活力的測定

纖維降解菌的性能大多用羧甲基纖維素酶來衡量。蔡燕飛等從自然界中篩選分離獲得具有高效分解纖維素功能的克雷伯氏菌、假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌，假單胞菌屬不僅能分解纖維素，而且對二氯酚、阿特拉津等有機廢棄物有降解功效，克雷伯氏菌屬有固氮和分解纖維素功能，嗜麥芽窄食單胞菌對植物發(fā)現(xiàn)各單一菌株對纖維素類物質均有一定的降解效果，其羧甲基纖維素CMC酶相對活性為0.93 cm·d-1[9]。本試驗通過液體發(fā)酵試驗，測定發(fā)酵后液體的纖維素酶活及濾渣的DM消失率，發(fā)現(xiàn)待選的7株菌中，纖維素酶活度最高能達到5.94 U·g-1，相應的DM消失率達到23.73%。中科院微生物菌種保藏中心的產纖維素酶專用菌株綠色木霉（trichodermasp）AS3·3711，在優(yōu)化的培養(yǎng)基上發(fā)酵，最高為7.0 U·g-1[10]。故可推測對菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，本試驗分離的7株菌的酶活力還能有所提高。

5 結論

分離得到19株對纖維降解有作用的菌株，其中有7株降解作用顯著，分別為R2、R3、R4、R5、R7、R14、R19，綜合剛果紅染色、纖維素酶測定及DM消失率測定，最終以R3效果最佳，其透明斑直徑/菌落直徑為6.27、纖維素酶活為5.94 U·g-1、DM消失率達到23.73%。

[1]Doerner K C,White B A.Assessment of the endo-1,4-beta-glu?canase components of ruminococcus flavefaciens FD-1[J].Ap?plied Environ Microbiology,1990,56（6）:1844-1850.

[2]Gerwig G J,De W P,Kamerling J P,et al.Novel O-linked car?bohydrate chains in the cellulase complex(cellulosome)of Clos?tridium thermocellum.3-O-Methyl-N-acetylglucosamine as a constituent of a glycoprotein[J].J Biol Chem,1989,264（2）:1027-1035.

[3]劉玉承.32株瘤胃纖維降解細菌的分離鑒定與保藏研究[D].呼和浩特:內蒙古農業(yè)大學,2007.

[4]張曉華,譚蓓英,劉敏雄.一個分解纖維素的瘤胃梭菌新種[J].微生物學報,1995,35（6）:397-399.

[5]彭海宏,木合塔爾,古麗格那,等.厭氧真菌在山羊瘤胃中的分離[J].草食家畜,1999（2）:24-25.

[6]王平.牛瘤胃中纖維降解菌的分離鑒定及對玉米秸稈發(fā)酵效果的研究[D].鄭州:河南農業(yè)大學,2010.

[7]郭成栓,歐陽蒲月,崔堂兵,等.一株堿性纖維素酶產生菌的分離、鑒定及酶譜分析[J].生物技術,2011,21（1）:57-59.

[8]Bowman J G,Firkins J L.Effects of forage species and particle size on bacterial cellulolytic activity and colonization in situ[J].Jour?nal of Animal Science,1993,71（6）:1623-1633.

[9]蔡燕飛,李華興,彭桂香,等.纖維素分解菌的篩選及鑒定[J].林產化學與工業(yè),2005,25（2）:67-70.

[10]曉芳,徐旭士,吳敏,等.一株纖維素分解菌的分離與篩選[J].生物技術,2001,11（2）:28-30.