天然乳酸菌飼料添加劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

劉彩紅 河北科技大學(xué) 050018

1 緒論

1.1 飼料添加劑的定義及應(yīng)用

1.1.1 青貯飼料

青貯是保存飼料營(yíng)養(yǎng)成分的基本方法，它可靠、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便。

青貯的過(guò)程實(shí)際上是一個(gè)復(fù)雜的微生物消長(zhǎng)演變的過(guò)程，主要是通過(guò)發(fā)酵達(dá)到延長(zhǎng)保質(zhì)期和防止?fàn)I養(yǎng)成分流失的目的。青貯的發(fā)酵過(guò)程分為三個(gè)階段，預(yù)備發(fā)酵期、酸化成熟期和完成保存期。青貯過(guò)程中，主要微生物有乳酸菌、梭狀芽孢桿菌、腐敗菌、醋酸菌、酵母菌以及霉菌等，其中起關(guān)鍵性作用的是乳酸菌。此過(guò)程中，青貯飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也發(fā)生著微弱的變化，主要的變化是青貯原料上的乳酸菌數(shù)量并不高，而青貯后乳酸菌的數(shù)量迅猛增加；發(fā)酵后糖的剩余量很少，基本上是半纖維素酶解所釋放的戊糖；含氮量會(huì)由于蛋白酶的作用而減少；等等。

青貯飼料中的乳酸菌。

乳酸菌只是一種習(xí)慣叫法，并不是微生物分類(lèi)學(xué)上的名稱(chēng)，但乳酸菌的習(xí)慣叫法已被廣大學(xué)者和民眾接受。張剛等給乳酸菌的定義是：乳酸菌是一類(lèi)能在可利用的碳水化合物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌。在自然界分布廣泛，在土壤、植物根際，許多人類(lèi)食品、動(dòng)物飼料，還有河水中都有乳酸菌。大多數(shù)乳酸菌有益于人體和動(dòng)植物，被稱(chēng)為“益生菌”。李平蘭等指出，大多數(shù)乳酸菌能分泌酶類(lèi)，形成生理性屏障，因此能間接地排斥、抑制有害菌的生長(zhǎng)。不僅如此，楊良等指出乳酸菌還有調(diào)節(jié)胃腸機(jī)能功、免疫等功能。周勃?jiǎng)t在《乳酸菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)的影響》一文中指出，在肉雞日食糧中合理加入乳酸菌，能降低病發(fā)率，降低料肉比，還能夠使雞羽毛光順、緊貼體表、發(fā)育整齊。

自從巴斯德于1857年首次在研究乳酸發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)乳酸菌后，乳酸菌就在人們的生產(chǎn)生活中發(fā)揮著重大的作用。而青貯飼料中乳酸菌的作用更是不容忽視。青貯飼料中的乳酸菌主要有乳球菌和乳桿菌等。青貯發(fā)酵過(guò)程中的條件控制就是創(chuàng)造乳酸菌最適生長(zhǎng)的環(huán)境條件。一般是含水量在60%～70%，溫度在40℃以下，其次對(duì)裝填量也有要求，一般是每30cm左右踩實(shí)一次，尤其要注意邊緣的踩實(shí)情況。

青貯過(guò)程是把青貯飼料貯存在缸、池、窖及塑料袋中，剛開(kāi)始主要是一些好氧性細(xì)菌（腐敗菌、霉菌、醋酸菌等）利用原料中殘存的氧氣進(jìn)行呼吸作用，pH值下降緩慢，待氧氣消耗盡，乳酸菌便成為優(yōu)勢(shì)菌群，開(kāi)始大量繁殖產(chǎn)生乳酸使原料酸堿度迅速下降并維持在3.5～4.2之間。在此酸度下好氧性微生物的生命活動(dòng)都處于抑制的穩(wěn)定狀態(tài)，蛋白酶的活性也受到了抑制。代素貞等指出，加入乳酸菌可使青貯中的游離氨基酸含量明顯下降，這樣便使青貯飼料的適口性增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不易流失。

1.1.2 飼料添加劑

飼料添加劑是指在飼料加工、制作、使用過(guò)程中添加少量或微量物質(zhì)。其目的在于完善飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不足，改善飼料品質(zhì)，提高飼料的利用率，抑制有害物質(zhì)的產(chǎn)生，防止畜禽疾病，增進(jìn)動(dòng)物健康，從而大大提高動(dòng)物生產(chǎn)能力，改進(jìn)畜產(chǎn)品品質(zhì)，節(jié)約飼料及增加經(jīng)濟(jì)效益。根據(jù)對(duì)青貯的使用目的和作用原理可將飼料添加劑分為微生物添加劑、營(yíng)養(yǎng)添加劑、防腐添加劑、吸附劑和發(fā)酵抑制劑。

微生物添加劑。

微生物添加劑（SIB）也稱(chēng)青貯接種菌，是專(zhuān)門(mén)用于飼料的一類(lèi)微生物添加劑。由一種或一種以上的乳酸菌、酶和一些活化劑組成。其目的是通過(guò)調(diào)節(jié)原料內(nèi)的微生物區(qū)系來(lái)調(diào)節(jié)和控制青貯的發(fā)酵過(guò)程，為乳酸菌的大量繁殖，短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量乳酸創(chuàng)造條件。從而增加青貯料中乳酸菌的數(shù)量，克服化學(xué)添加劑的不足和為調(diào)制優(yōu)質(zhì)青貯料提供保證。國(guó)外對(duì)微生物添加劑的研究較早，時(shí)建忠在《國(guó)外青貯接種菌研究進(jìn)展》中詳細(xì)闡述了國(guó)外接種菌的研究狀況，他指出，美國(guó)所接種的乳酸菌活力旺盛，每克原料的乳酸菌達(dá)到105之高，而且并不是單一的菌系。在我國(guó)國(guó)標(biāo)中規(guī)定的作為飼料添加劑的微生物有地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母及沼澤紅假單胞菌。然而，我國(guó)現(xiàn)在市場(chǎng)上同類(lèi)的產(chǎn)品依然較少，存在的缺點(diǎn)也很顯著，主要是產(chǎn)品的菌種單一，不能將菌系聯(lián)合應(yīng)用，貯藏期短導(dǎo)致很難推廣。

防腐添加劑。

防腐劑是指天然或合成的化學(xué)成分，用于加入到食品、藥品、顏料、生物標(biāo)本中，以延遲微生物生長(zhǎng)或化學(xué)變化引起的腐敗。其主要作用是抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖，以延長(zhǎng)物質(zhì)保存時(shí)間，抑制物質(zhì)腐敗。常用的有亞硝酸鹽、甲醛等。甲醛是研究較多的一類(lèi)青貯飼料防腐添加劑，甲醛俗稱(chēng)福爾馬林，商業(yè)用的是40%的甲醛水溶液。甲醛可以抑制各種微生物的活動(dòng)，不僅具有良好的防腐作用，而且可以防止飼料蛋白質(zhì)在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)被降解。但有研究表明，甲醛具有潛在的致癌危險(xiǎn)，用時(shí)應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。

1.1.3 乳酸菌飼料添加劑

乳酸菌是青貯飼料微生物添加劑中最重要的一種，也是應(yīng)用最早的一種。依照乳酸菌產(chǎn)酸的能力可以分為兩類(lèi)：同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌，而青貯過(guò)程中起關(guān)鍵性作用的是同型發(fā)酵乳酸菌。篩選并培養(yǎng)最適合的發(fā)酵青貯用乳酸菌成為近30年青貯研究的熱點(diǎn)。目前使用的菌種有Lactobacillus plantarum，Enterococcus faecium 和Pediococcus pentosaceus等。乳酸菌的益生作用受到了人們的廣泛關(guān)注，它們的生物學(xué)功能更是不可忽視，尤其是其維持微生態(tài)平衡和腸道機(jī)能的作用、抗菌作用、降低血清膽固醇水平的作用和增強(qiáng)免疫功能和預(yù)防腫瘤的作用。把乳酸菌作為青貯飼料添加劑主要是利用了乳酸菌的抑菌作用。飼料接種乳酸菌后pH值會(huì)快速下降，其他腐敗菌因不能在較低pH值下生存而死亡，最終的pH值也會(huì)達(dá)到很低的水平，有助于降低那些產(chǎn)生高水平乙酸、丁酸的有害微生物的數(shù)量，而且能提高干物質(zhì)的回收率，從而最終提高青貯飼料的利用率。

1.2 細(xì)菌素

1.2.1 細(xì)菌素的定義

細(xì)菌素是一種多肽或多肽與糖和脂的復(fù)合物，是許多細(xì)菌產(chǎn)生的抗細(xì)菌肽或蛋白。細(xì)菌素既可自發(fā)產(chǎn)生也可誘導(dǎo)產(chǎn)生。細(xì)菌素不同于抗生素，細(xì)菌素由質(zhì)?？刂疲瑢?duì)同種近緣菌株呈現(xiàn)狹窄的活性抑菌譜，附著在敏感細(xì)胞特異性受點(diǎn)上，雖然細(xì)菌素的抗菌譜很窄，只能作用于特定的有害菌，但若能選擇適合的細(xì)菌素，就能保證在抑制有害菌種的同時(shí)不會(huì)影響其他有益菌種的存活。細(xì)菌素本質(zhì)上是蛋白質(zhì)類(lèi)，可以被消化道中的特定蛋白酶降解，在腸道中不會(huì)有殘留，而抗生素是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌）或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，是能干擾其它活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。重復(fù)使用抗生素可能會(huì)使致病菌產(chǎn)生抗藥性。與抗生素相比較，生產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生的細(xì)菌素具有免疫功能，這也是細(xì)菌素與抗生素的主要區(qū)別。

1.2.2 細(xì)菌素的應(yīng)用及展望

細(xì)菌素?zé)o毒、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性、無(wú)副作用，不僅具有防腐的作用，而且不會(huì)在體內(nèi)積蓄引起不良反應(yīng)，在體內(nèi)易被消化道中的部份蛋白酶降解。甘曉玲指出，細(xì)菌素用于奶制品可以抗Clostridial和Listeria。奶制品中，Nisin的使用最為廣泛也最為成熟，已成功地應(yīng)用于乳制品如硬制干酪、巴氏桿菌干酪、巴氏滅菌奶、罐藏濃縮牛奶、高溫滅菌奶、高溫處理風(fēng)味奶和酸奶等。

目前國(guó)際上通常采用物理和化學(xué)兩種方法對(duì)食品進(jìn)行防腐保鮮。與工業(yè)用防腐劑不同，食品防腐劑的安全衛(wèi)生問(wèn)題日益受到人們關(guān)注，消費(fèi)者對(duì)添加化學(xué)防腐劑的食品心存顧忌?；瘜W(xué)防腐劑的安全隱患不容忽視，尋找一種新的代用品以減少化學(xué)防腐劑所造成的潛在危害已為各國(guó)科研工作者所關(guān)注。然而隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，人們對(duì)食品安全性的要求越來(lái)越高。因此，選擇安全有效的防腐劑成為食品防腐保鮮的一項(xiàng)重要工作。人們把研究重點(diǎn)放在生物防腐劑的研究中并取得了很好的效果。生物防腐劑是通過(guò)生化反應(yīng)來(lái)達(dá)到防腐的效果。細(xì)菌素作為生物防腐劑的一種，具有其他非微生物防腐劑所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)，因此應(yīng)用前景廣泛。目前，新型細(xì)菌素的研究手段層出不窮，包括人工合成、克隆技術(shù)、基因組序列等。我們有理由相信在不久的將來(lái)一定會(huì)更加詳盡地揭示出細(xì)菌素的功能、抑菌原理、基因結(jié)構(gòu)甚至是遺傳位點(diǎn)。

1.3 乳酸菌細(xì)菌素

1925 年，Gratia發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌產(chǎn)生的Co1icine。以后幾十年國(guó)外學(xué)者開(kāi)始了乳酸菌細(xì)菌素的研究，研究方向主要集中在對(duì)Nisin的研究。近幾年國(guó)外學(xué)者對(duì)乳酸菌細(xì)菌素的研究主要集中在提取新的乳酸菌細(xì)菌素、細(xì)菌素檢測(cè)方法、細(xì)菌素的純化方法、細(xì)菌素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和編碼基因等方面。乳酸菌細(xì)菌素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上不同部位有不同的電價(jià)，可造成指示菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的部分改變，其主要?dú)⒕鷻C(jī)制是先吸附在目標(biāo)菌的細(xì)胞膜上，再侵入膜內(nèi)形成通透孔道，以引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如ATP、K+等的流失或細(xì)胞生化反應(yīng)障礙，而導(dǎo)致目標(biāo)菌的死亡。

目前，乳酸菌是世界上公認(rèn)的食品級(jí)微生物，當(dāng)然其產(chǎn)生的乳酸菌細(xì)菌素也是安全的。乳酸菌細(xì)菌素對(duì)病原菌和食品腐敗菌均有抑制能力，可以把乳酸菌細(xì)菌素作為天然防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)。根據(jù)生物多樣性和進(jìn)化論觀(guān)點(diǎn)，每種乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素至少有一種，并且具有相對(duì)固定的抗菌譜。研究表明，溫度和酸堿度都能影響乳酸菌細(xì)菌素的活力。如單春?jiǎn)痰纫源竽c埃希菌為指示菌作嗜熱乳桿菌的抑菌試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)隨溫度的升高，抑菌活性變化不大，活性均能達(dá)到80%以上。陳靜等指出，嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌活性只有在酸性條件下才能表現(xiàn)出來(lái)，并隨酸度的升高抑菌活性也隨之升高。目前，乳酸菌細(xì)菌素已成功地應(yīng)用于乳制品如硬制干酪、巴氏桿菌干酪、巴氏滅菌奶、罐藏濃縮牛奶、高溫滅菌奶、高溫處理風(fēng)味奶、酸奶等；肉制品如熏豬肉、咸豬肉、香腸、火腿、真空包裝新鮮牛肉等；罐裝蔬菜如番茄、馬鈴薯、蘑菇、龍須菜等。

1.4 本課題研究的目的與意義

近30年來(lái)，國(guó)內(nèi)外青貯技術(shù)研究的熱點(diǎn)主要集中在生物青貯劑的研究方面。生物青貯劑通過(guò)調(diào)節(jié)控制青貯發(fā)酵過(guò)程，促進(jìn)乳酸菌大量繁殖更快地產(chǎn)生乳酸，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而有效地提高青貯飼料的質(zhì)量。國(guó)外眾多的科技人員對(duì)此做了大量的科研工作，如Giorgio Giraffa指出，乳酸菌是廣泛用于青貯飼料的添加菌株，其主要代謝產(chǎn)物乳酸可以迅速降低原料的pH值，可以提高飼料的適口性，而且所產(chǎn)生的細(xì)菌素影響著最終產(chǎn)品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)。我國(guó)在該領(lǐng)域的研究還剛剛起步，飼料添加劑的應(yīng)用研究需要給予高度重視。

本課題隨機(jī)抽取了河北省五個(gè)市縣的青貯飼料，從青貯飼料中分離篩選一株或幾株性質(zhì)優(yōu)良的乳酸菌，并用篩選得到的乳酸菌發(fā)酵棉粕。主要針對(duì)乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中的代謝物在抑菌方面和營(yíng)養(yǎng)細(xì)化方面加以研究，同時(shí)以測(cè)定棉粕中棉酚和蛋白質(zhì)含量的變化作為青貯飼料營(yíng)養(yǎng)提高的一個(gè)觀(guān)測(cè)點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)益生菌制品、生物防腐劑提供基礎(chǔ)性材料和理論依據(jù)。隨著對(duì)綠色、環(huán)保、無(wú)公害畜產(chǎn)品的需求增加，能代替抗生素的抗菌劑成為人們尋找的目標(biāo)，細(xì)菌素便成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

1.5 試驗(yàn)路線(xiàn)

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 青貯飼料

所用青貯飼料來(lái)自河北省五個(gè)市縣。見(jiàn)表1。

表 1 青貯飼料來(lái)源

2.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

以河北科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌作為指示菌。

2.1.3 棉粕

棉粕：四級(jí)品。

2.1.4 藥品試劑

蛋白胨（北京奧博星），酵母膏（北京奧博星），牛肉膏（北京奧博星），葡萄糖（天津百世），吐溫80（天津紅巖），硫酸鎂（天津永大），硫酸錳（天津培歡），氫氧化鈉（天津大陸），氯化鈉（天津富祿），瓊脂（北京奧博星），丙三醇（天津永大），乙酸鉛（天津化學(xué)試劑三廠(chǎng)），30%過(guò)氧化氫（石家莊市衛(wèi)民消毒制品），氫氧化鉀（天津百世），明膠（天津博迪）。以上試劑均為化學(xué)純。

2.1.5 培養(yǎng)基

TGE肉湯培養(yǎng)基的配制：蒸餾水1000mL、蛋白胨10.00g、酵母浸提物4.00g、牛肉膏6.00g、葡萄糖 10.00g、硫酸錳 0.05g、硫酸鎂 0.10g、吐溫 80為0.2%，pH 為 6.5，0.08Mpa滅菌 30min。

MRS液體培養(yǎng)基的配制：蒸餾水1000mL、蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、酵母提取物 5.0g、K2HPO4 2.0g、檸檬酸三銨 2.0g、乙酸鈉 5.0g、葡萄糖 20.0g、 吐 溫 80 1.0mL、MgSO4·7H2O 0.5g、MnSO4 ·4H2O 0.25g，pH6.2 ～6.4，115℃ 滅 菌25min。

硫化氫培養(yǎng)基的配制：蒸餾水1000mL、蛋白胨 10g、牛肉膏 3g、酵母提取物 5g、NaCl 5g、半胱氨酸 0.4g、葡萄糖 2g，pH7.2～7.4，113℃攝氏度滅菌20min。明膠液化培養(yǎng)基的配制：明膠12g、蛋白1g、酵母提取1g、葡萄糖0.1g、鹽溶液4.0mL、蒸餾水 100mL，pH7.0，113℃～115℃高壓蒸汽滅菌 15～20min。

乙酰甲基甲醇（PY）培養(yǎng)基的配制（VP試驗(yàn)）：蛋白胨0.5g、胰酶解酪朊0.5g、酵母提取物1.0g、鹽溶液4.0mL、蒸餾水100mL。

鹽溶液成分：蒸餾1000mL、無(wú)水CaCl2 0.2g、MgSO4 ·7H2O 0.48g、K2HPO4 1.0g、KH2PO4 1.0g、NaHCO3 10.0g、NaCl 2.0g。

LB液體培養(yǎng)基的配制：蒸餾水 1000mL、NaCl 10.00g、蛋白胨 10.00g、酵母浸提物 0.50g、用 5mL NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2，0.15Mpa滅菌 20min。

牛肉膏蛋白胨（肉湯）培養(yǎng)基的配制：蒸餾水1000mL、牛肉膏 3.00g、NaCl 5.00g、蛋白胨 8.00g、用5M NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4～7.6，0.15Mpa滅菌20 min。

固體、半固體培養(yǎng)基的配制：在上述液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉制備固體培養(yǎng)基，加入0.8%瓊脂粉制備半固體瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.6 儀器

HYG-XX自動(dòng)搖床 （上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司）

HHB11-600電熱恒溫培養(yǎng)箱 （天津市華北實(shí)驗(yàn)器材有限公司）

SW-CY-2FD潔凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）

YXQG02電熱手提式蒸汽壓力滅菌鍋（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）

BC|BD-24|GSA 2G海爾電冰柜 （山東青島海爾有限公司）

J200G＆G高精度電子秤 （上海麗度電子科技發(fā)展有限公司）

IH-G20富士寶電磁爐 （富士寶電器科技有限公司）

B1 Series Motic顯微鏡 （麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）

CSIOI3電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶儀器）

DL-1510低溫冷卻液循環(huán)機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）

LABOROTA 4000 EFFICIENT旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph集團(tuán)）

BAKER SPE-24固相萃取儀（美國(guó)JT Baker）

GP/5-2SV1-S1FR空氣壓縮機(jī) （日本島津公司）

81-2 恒溫磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器廠(chǎng)）

AA-6100原子吸收分光光度計(jì) （日本島津公司）

infraxact/近紅外分析儀（丹麥福斯集團(tuán)公司）

SOXTEC-2043索氏脂肪提取儀（丹麥福斯集團(tuán)公司）

ANKOM-220粗纖維測(cè)定儀 （美國(guó)ANKOM公司）

PHOENIX微波馬弗爐（美國(guó)CEM公司）

ETHOSE微波消解爐（意大利麥爾斯通公司）

KJELTEC-2300蛋白消化爐（丹麥福斯集團(tuán)公司）

KJELTEC-2300全自動(dòng)定氮儀（丹麥福斯集團(tuán)公司）

2.2 方法

2.2.1 樣品的制備

在青1、青 2、青 3、青 4、青 5中分別取少量青貯飼料于生理鹽水中，震蕩均勻后，濾去青貯飼料殘留物，將所得液體進(jìn)行涂布培養(yǎng)。

2.2.2 乳酸菌的分離培養(yǎng)

涂布培養(yǎng)：用移液槍將震蕩后的液體接種于已滅菌的MRS固體培養(yǎng)基上，用"L"形玻璃棒反復(fù)涂布幾次，直到使菌液均勻分散在固體培養(yǎng)基表面。于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h。

制備乳酸菌懸液：用接種環(huán)挑取有典型特征的菌落置于裝有已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，于自動(dòng)搖床內(nèi)培養(yǎng)24h。

斜面接種法：用接種環(huán)蘸取菌液從已滅菌的MRS培養(yǎng)基的固體斜面的底部向上蜿蜒涂布，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h。

傾注平板法：將菌液和培養(yǎng)基在適宜的溫度混合均勻后，傾入已滅菌的平皿內(nèi)，待凝固后在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

穿刺接種法：從試管中用滅菌的接種針蘸取適量菌液垂直刺入已滅菌的培養(yǎng)基的中心直達(dá)試管底部，但不完全刺到管底，在適宜溫度下培養(yǎng)。

2.2.3 菌種保藏

將滅菌后的甘油和菌液以1∶1(500μL)的比例混合移入1.5mL離心管中，于-18℃的冰箱內(nèi)保藏，備用。

2.2.4 乳酸菌的鑒定

革蘭氏染色觀(guān)察：用滅菌的接種環(huán)蘸取菌液置于干凈的載玻片上，經(jīng)過(guò)制片后經(jīng)初染、媒染、脫色、復(fù)染后觀(guān)察菌株的顏色、大小，并記錄形狀。

乙酰甲基甲醇（VP實(shí)驗(yàn)）：

甲液：6%α-萘酚-乙醇溶液；乙液：40%氫氧化鉀溶液。

取適量菌液置于試管內(nèi)，加入6%α-萘酚-乙醇溶液1mL，然后加入40%氫氧化鉀溶液0.4mL，充分震蕩后37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)15～20min后觀(guān)察，若溶液出現(xiàn)紅色則為VP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。

KOH實(shí)驗(yàn)：用滅菌的玻璃棒蘸取5%的KOH溶液置于干凈的載玻片上，用滅菌的接種環(huán)蘸取菌液置于KOH溶液中，并用接種環(huán)迅速攪拌，若短時(shí)間內(nèi)越攪越稠，且挑起會(huì)有拉絲的現(xiàn)象，則此為KOH實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。

過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)：用滅菌的接種環(huán)蘸取菌液涂于干凈的載玻片上，滴加30%過(guò)氧化氫，若有氣泡產(chǎn)生則為過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。

硫化氫實(shí)驗(yàn)：

乙酸鉛試紙條的制備：將普通濾紙剪成約0.5～0.6cm寬的紙條，長(zhǎng)度根據(jù)試管和培養(yǎng)基高度而定。用50～100g/L的乙酸鉛將紙條浸透，置于烘箱內(nèi)烘干，然后放入培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，滅菌后備用。

觀(guān)察現(xiàn)象，若紙條變黑為過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。

葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)：

培養(yǎng)基（1000mL）：在PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入30g葡萄糖、0.5mL吐溫80和6g瓊脂，再加入濃度為1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示劑，分裝試管，濕熱滅菌（121℃，0.1MPa，20min），豎立靜置，自然降溫凝固，備用。

接種培養(yǎng)及觀(guān)察：用較大量的新鮮活力強(qiáng)的待測(cè)菌液進(jìn)行穿刺接種，豎直放在試管架上于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，24～48h）。觀(guān)察并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，培養(yǎng)基中指示劑變黃表示產(chǎn)酸；軟瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡表示產(chǎn)氣。

明膠液化實(shí)驗(yàn)：將菌液接種于明膠液化培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間后置于冰箱中，待試管凝固。如對(duì)照管凝固時(shí)，接種管液化為明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，同時(shí)凝固為陰性。

吲哚實(shí)驗(yàn)：吲哚試劑的配制：將1g對(duì)二甲氨基甲醛溶液溶解于95mL的95%乙醇中，然后緩慢加入濃鹽酸20mL。于試管中加入5mL滅菌的蛋白胨水培養(yǎng)基，用移液槍移入100μL，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀(guān)察，并作空白對(duì)照。首先加入乙醚2mL，充分震蕩后靜置幾分鐘，再沿試管壁加入5～10滴吲哚試劑。若乙醚層出現(xiàn)玫瑰紅色則為吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。

2.2.5 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選（瓊脂擴(kuò)散法）

培養(yǎng)指示菌：

選取大腸桿菌和枯草芽孢桿菌兩株菌種作為指示菌。用接種環(huán)挑取活化的大腸桿菌接種于5mL的LB培養(yǎng)基37℃自動(dòng)搖床培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑取活化的枯草芽孢桿菌接種于5mL的肉湯培養(yǎng)基37℃自動(dòng)搖床培養(yǎng)24h，4℃冰箱保存待用。

制備濾紙片。

將適量濾紙用打孔機(jī)打成6mm的圓形濾紙片，115℃滅菌20min后備用。

篩選：

將200μL菌液放在離心管中，于-18℃下反復(fù)凍融5次，備用。

將100μL指示菌與對(duì)應(yīng)的200mL培養(yǎng)基混合均勻后倒入平板內(nèi)，用鑷子夾起濾紙片在離心管內(nèi)浸濕，將浸滿(mǎn)菌液的濾紙片放在固體培養(yǎng)基的適當(dāng)位置。同時(shí)，用氫氧化鈉中和菌液，把菌液調(diào)至中性后，將100μL指示菌與對(duì)應(yīng)的200mL培養(yǎng)基混合均勻后倒入平板內(nèi)，用鑷子夾起濾紙片在離心管內(nèi)浸濕，將浸滿(mǎn)菌液的濾紙片放在固體培養(yǎng)基的適當(dāng)位置。將兩種平皿同時(shí)置于37℃下靜置培養(yǎng)16h后觀(guān)察結(jié)果，并用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈大小，測(cè)定3次，取平均值。

2.2.6 生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

將抑菌效果好的菌株接種于裝有滅菌的TGE液體培養(yǎng)基的試管中，在37℃下自動(dòng)搖床培養(yǎng)。從第4個(gè)小時(shí)起，每隔兩小時(shí)取出一支并立即在600nm下測(cè)定光密度值，同時(shí)采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定相應(yīng)菌株的菌落總數(shù)。

測(cè)菌落總數(shù)時(shí)采用的稀釋方法為梯度稀釋法，即在第一個(gè)試管中放9mL培養(yǎng)基，用移液槍移入1mL菌液，混合均勻后，從第一個(gè)試管中用移液槍取出1mL菌液放入第二個(gè)裝有9mL培養(yǎng)基的試管中，稀釋到一定倍數(shù)后取200μL菌液于固體培養(yǎng)基上涂布均勻后培養(yǎng)，直到數(shù)出的菌落數(shù)在30～300之間，停止稀釋。

2.2.7 發(fā)酵指標(biāo)的測(cè)定

發(fā)酵時(shí)菌液接種量：

為保證發(fā)酵后所測(cè)指標(biāo)的可比性，要使接種量至少達(dá)到105CFU/g。若菌落數(shù)較小則通過(guò)離心的方法獲取沉淀物，若菌落數(shù)較大則加培養(yǎng)基，如此循環(huán)，直到總量一致為止。

本課題選取了菌落總數(shù)為2×1010CFU的菌液，將菌液與200mL無(wú)菌水和滅菌后的200g棉粕混合均勻后，在37℃條件下發(fā)酵4天，測(cè)定pH并進(jìn)行晾曬，晾干后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

游離棉酚測(cè)定：

將棉粕樣品用機(jī)械磨粉碎，使其全部能夠通過(guò)2.8mm孔篩，混勻后裝入密閉容器中，保存?zhèn)溆谩?/p>

稱(chēng)取2.000g樣品，置于250mL帶塞的三角錐形瓶中，加入20粒玻璃珠，用移液管吸取50mL溶劑A（量取約2mL3-氨基-1-丙醇，500mL異丙醇、正己烷混合溶劑，50mL水、8mL冰乙酸于1000mL的容量瓶中，再用異丙醇-正己烷混合溶劑定容至刻度），塞緊瓶塞后將其放入振蕩器內(nèi)振蕩1h（每分鐘120次左右）。隨后用干燥的定墩濾紙過(guò)濾，過(guò)濾的時(shí)候要在漏斗上加蓋玻璃片，這樣做的目的是減少溶劑揮發(fā)。將最初得到的幾滴濾液棄去不用，將濾液收集在100mL帶塞三角錐形瓶中。

用吸量管吸取兩份等量的濾液10mL，分別裝入兩個(gè)25mL棕色容量瓶a和b中。

用異丙醇-正己烷混合溶劑稀釋瓶a至刻度，搖勻后，作為樣品的對(duì)照組。

用移液管吸取2份10mL的溶劑A分別至兩個(gè)25mL棕色容量瓶a0和b0中。

用異丙醇-正己烷混合溶劑將容量瓶a0稀釋至刻度，搖勻后，將該溶液作為空白的對(duì)照組。

在容量瓶b和b0中加人2.0mL苯胺，在沸水浴上加熱30min，使其顯色。

將其冷卻至室溫后，用異丙醇-正己烷混合溶劑定容，搖勻后，靜置1h。

用10mm比色皿，采用分光光度計(jì)以a0為參比溶液測(cè)定空白測(cè)定液b0的吸光度，在波長(zhǎng)440nm處，以a為參比溶液測(cè)定試樣測(cè)定液b的吸光度，從樣品測(cè)定液的吸光度值中減去空白測(cè)定液的吸光度值，就可以得到校正吸光度A。

計(jì)算公式為：

式中：X-游離棉酚含量，mg/Kg

A-校正吸光度

m-試樣質(zhì)量，g

V-測(cè)定用濾液的體積，mL

a-質(zhì)量吸收系數(shù)，游離棉酚為62.5cm-1·g-1·L

粗蛋白測(cè)定：

參照GB/T6432-94進(jìn)行粗蛋白測(cè)定。

方法：將樣品進(jìn)行粉碎，使其能全部通過(guò)40目篩。

稱(chēng)取0.5000g樣品，放入消化管中，再加入兩片消化片，在420℃下于消煮爐上消化1h，然后取出，待放涼后加入30mL的蒸餾水。

用全自動(dòng)定氮儀按儀器本身常量程序進(jìn)行測(cè)定。

再用0.1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液對(duì)吸收液進(jìn)行滴定，當(dāng)溶液的顏色有藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色即為滴定終點(diǎn)。

同時(shí)做空白對(duì)照，稱(chēng)取0.5g的蔗糖，用來(lái)代替試樣，按以上操作進(jìn)行空白測(cè)定，要求消耗0.1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積小于或等于0.2mL。然后根據(jù)下面的計(jì)算公式，得出蛋白質(zhì)的含量：

式中：V2-滴定樣品時(shí)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液體積

V1-滴定空白時(shí)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液體積

C-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L

m-試樣的質(zhì)量，g

V′-試樣分解液蒸餾用體積，mL

V-試樣分解液總體積，mL

0.0140 -每毫克當(dāng)量氮的克數(shù)

6.25 -氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)

脂肪測(cè)定：

參照GB2433-2006進(jìn)行脂肪測(cè)定。

稱(chēng)取 5g（m1）式樣，準(zhǔn)確稱(chēng)量至 1mg。

將試料轉(zhuǎn)移至一個(gè)400mL燒杯或一個(gè)300mL錐形瓶中，加100mL鹽酸和金剛砂，用表面皿覆蓋，或?qū)㈠F形瓶與回流冷凝器連接，在火焰上加熱混合物至微沸，保持1h，每10min旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)1次，防止產(chǎn)物粘附于容器壁上。在環(huán)境溫度下冷卻，加一定量的濾器輔料，防止過(guò)濾時(shí)脂肪丟失，在布氏漏斗中通過(guò)濕潤(rùn)的無(wú)脂的雙層濾紙抽吸過(guò)濾，殘?jiān)美渌礈熘林行?。小心取出濾器并將含有殘?jiān)碾p層濾紙放入一個(gè)提取套管中，在80℃電熱真空箱中于真空條件下干燥60min，從電熱真空箱中取出套管并用以小塊脫脂棉覆蓋。

將一些金剛砂轉(zhuǎn)移至干燥燒瓶，稱(chēng)量（m2）準(zhǔn)確至1mg。將套管置于提取器中，用石油醚提取6h。蒸餾出去溶劑，直至燒瓶中幾乎無(wú)溶劑，加2mL丙酮至燒瓶中，轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶并在加熱裝置上緩慢加溫以除去丙酮，吹去痕量丙酮。殘?jiān)?03℃干燥箱內(nèi)干燥（10±0.1）min，在干燥器中冷卻，稱(chēng)量（m3），準(zhǔn)確至 0.1mg。

式中：

m1-試料的質(zhì)量，單位為g

m2-帶有金剛砂的燒瓶的質(zhì)量，單位為g

m3-盛有金剛砂的燒瓶和獲得的石油醚提取干燥殘?jiān)馁|(zhì)量，單位為g

f-校正因子單位，單位為g/Kg(f=1000g/Kg)

結(jié)果表示準(zhǔn)確至1g/Kg

粗纖維測(cè)定：

參照GB2434-2006進(jìn)行粗纖維測(cè)定。

稱(chēng)取約1g制備好的試樣準(zhǔn)確至0.1mg，轉(zhuǎn)移至一帶有約2g濾器輔料的濾鍋中。

將消煮圓筒與濾鍋連接，將150mL沸硫酸轉(zhuǎn)移至帶有濾鍋的圓筒中，如果出現(xiàn)泡沫，則加數(shù)滴發(fā)泡劑，使硫酸盡快沸騰，并保持劇烈沸騰30min±1min。

停止加熱，打開(kāi)排放管旋塞，在真空條件下通過(guò)濾鍋將硫酸濾出，殘?jiān)脽崴辽傧礈?次，每次用水30mL，洗滌至中性，每次洗滌后抽吸干燥殘?jiān)?/p>

將干過(guò)與冷提取裝置連接，殘?jiān)谡婵諚l件下用丙酮洗滌3次，每次用丙酮30mL。然后，殘?jiān)谡婵諚l件下用石油醚洗滌3次，每次用石油醚30mL。每次洗滌后抽吸干燥殘?jiān)?/p>

關(guān)閉排出孔旋塞，將150mL沸騰的氫氧化鉀溶液轉(zhuǎn)移至帶有濾鍋的圓筒中，加數(shù)滴防泡劑使溶液盡快沸騰，并保持劇烈沸騰30min±1min。

停止加熱，打開(kāi)排放管旋塞，在真空條件下通過(guò)濾鍋將硫酸濾出，殘?jiān)脽崴辽傧礈?次，每次用水30mL，洗滌至中性，每次洗滌后抽吸干燥殘?jiān)?/p>

將濾鍋置于灰化皿中，灰化皿及其內(nèi)容物在130℃干燥箱中至少干燥2h。濾鍋和灰化皿在干燥器中冷卻，從干燥器中取出后，立即對(duì)濾鍋和灰化皿進(jìn)行稱(chēng)量（m2），準(zhǔn)確至 0.1mg。

將濾鍋和灰化盤(pán)置于馬福爐中，其內(nèi)容物在525℃下灰化，直至冷卻后連續(xù)兩次稱(chēng)量的差值不超過(guò)2mg。每次灰化后，讓濾鍋和灰化皿初步冷卻，在尚溫?zé)釙r(shí)置于干燥箱中，使其完全冷卻，然后稱(chēng)量（m3），準(zhǔn)確至 0.1mg。

用大約相同數(shù)量的濾器輔料，按以上步驟進(jìn)行空白測(cè)定，不加試樣?；一鸬馁|(zhì)量損失不應(yīng)超過(guò)2mg。

試樣中粗纖維的含量按下式計(jì)算：

結(jié)果精確至1g/Kg。

水分含量測(cè)定：

根據(jù)GB/T10360的要求制備試樣。用清理好的機(jī)械磨粉碎樣品，機(jī)械磨需要用約5%的試樣清洗，然后將粉碎物棄去不用。將其余的試樣粉碎，使其能全部通過(guò)孔徑為1mm的篩子，然后收集粉碎物，混勻后盡快用于測(cè)試。

其測(cè)定方法為：將平皿開(kāi)蓋放置于烘箱中，溫度為40℃，放置0.5h。然后蓋上蓋，稱(chēng)量其重量。

稱(chēng)5g樣品，均勻鋪在平皿底上，然后蓋上蓋子稱(chēng)量。此操作應(yīng)盡快完成，防止樣品中的水分發(fā)生變化。

將此裝有樣品的平皿放置于電熱烘箱中，溫度調(diào)節(jié)為103℃，然后打開(kāi)蓋子，關(guān)上烘箱門(mén)。從溫度到達(dá)103℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，2h后打開(kāi)烘箱門(mén)，蓋上蓋子，切斷電源，關(guān)閉烘箱門(mén)，自然冷卻。待冷卻至室溫后，迅速稱(chēng)重。

稱(chēng)重完畢，將平皿再次放入電烘箱，開(kāi)蓋，關(guān)上烘箱門(mén)，從溫度到達(dá)103℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，1h后蓋上蓋，重復(fù)上述操作，冷卻后稱(chēng)重，直到兩次連續(xù)稱(chēng)量之差等于或小于0.005g為止。

晾干前后pH測(cè)定：

用緩沖液以蒸餾水為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整pH，將pH計(jì)調(diào)"0"。

稱(chēng)取棉粕5.0g放入75mL的蒸餾水中混合均勻，將pH計(jì)放入溶液，待pH計(jì)讀數(shù)穩(wěn)定后開(kāi)始計(jì)數(shù)，拿出后用蒸餾水清洗電極，測(cè)定下一樣品。

3 結(jié)果與討論

3.1 乳酸菌的分離與鑒定

經(jīng)革蘭氏染色觀(guān)察和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，共分離出51株乳酸菌，乳酸菌基本為桿狀和球狀。從革蘭氏染色結(jié)果和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）綜合觀(guān)察，查閱伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)，得知所分離的菌屬多為乳桿菌屬和鏈球菌屬。

從青1分離出了11株乳酸菌，記為XL1，XL1-1，XL11，XL15，XL12，XL13，XL14，XL1-1，XL1-2，XL11-1，XL11-2。

從青2中分離出了11株乳酸菌，記為XL2，XL2-3，XL22，XL22-1，XL21，XL22，XL23，XL24，XL2-1，XL22-1，XL22-2。

從青3中分離出了16株乳酸菌，記為XL3，XL3-1，XL33，XL33-1，XL33-2，XL331-1，XL331-2，XL332-1，XL332-2，XL31，XL32，XL3-2，XL34，X331-3，XL35，XL334-1。

從青4中分離出了6株乳酸菌，記為XL4，XL4-1，XL44，XL44-1，XL4-3，XL4-5。

從青5中分離出了7株乳酸菌，記為XL5，XL5-1，XL5-2，XL5-3，XL55，XL55-1，XL5-5

表 2 乳酸菌鑒別生理生化實(shí)驗(yàn)

注：“+”表陽(yáng)性，“-”表陰性

3.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

發(fā)酵液抑菌效果見(jiàn)表3。

表 3 發(fā)酵液抑菌效果

XL33-2 XL331-1 XL331-2 XL332-1 XL332-2 XL44 XL44-1 XL55 XL55-1 XL15 XL12 XL13 XL14 XL21 XL22 XL23 XL24 XL31 XL32 XL1-1 XL1-2 XL11-1 XL11-2 XL2-1 XL22-1 XL22-2 XL2-3 XL34 XL331-3 XL35 XL334-1 XL4-3 XL4-5 XL5-5 6.56 6.44 6.26 6.28 9.02 7.12 7.58 6.62 6.46 6.56 6.52 6.08 6.50 6.36 6.40 6.24 6.22 6.48 6.62 7.02 6.34 6.68 6.60 6.24 6.42 6.58 6.86 6.56 6.78 6.36 6.20 7.00 6.24 7.32 7.06 6.88 7.04 6.48 9.02 8.66 8.98 6.78 7.08 6.72 7.42 6.88 6.78 6.64 6.90 6.90 6.92 6.60 6.78 6.98 6.28 7.42 6.52 8.00 7.08 6.56 7.82 6.26 6.78 6.62 6.34 7.24 6.80 7.22

從表3中可以看出，發(fā)酵液同時(shí)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的乳酸菌菌株較少，而抑菌圈顯著較大的僅為14株，分別為XL44，XL332-2，XL5-5，XL44，XL4-1，XL44-1，XL2-3，XL5-3，XL1-1，XL2-1，XL11，XL4-3，XL3-1 和 XL1。

大多數(shù)菌株只能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌。如XL24抑制革蘭氏陰性菌的抑菌圈達(dá)到了6.92而抑制革蘭氏陰性菌的抑菌圈大小僅為6.22。

只有極少數(shù)乳酸菌菌株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌幾乎沒(méi)有效果，一共2株，分別為XL4和XL11-2。

排除酸影響后的效果見(jiàn)表 4。

表 4 排除酸抑菌效果

XL15 XL12 XL13 XL14 XL21 XL22 XL23 XL24 XL31 XL32 XL1-1 XL1-2 XL11-1 XL11-2 XL2-1 XL22-1 XL22-2 XL2-3 XL34 XL331-3 XL35 XL334-1 XL4-3 XL4-5 XL5-5 6.38 6.04 6.00 6.36 6.04 6.34 6.08 6.00 6.24 6.08 6.46 6.26 6.02 6.48 7.08 6.00 6.38 6.46 6.00 6.44 6.28 6.06 8.00 6.06 6.96 6.06 6.44 6.24 6.48 6.52 6.00 6.62 6.66 6.42 6.12 6.00 6.08 6.94 6.34 6.06 7.06 6.38 7.58 6.22 6.00 6.58 6.20 6.96 6.44 7.00

從表4中可以看出，發(fā)酵液同時(shí)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的乳酸菌菌株較少，而抑菌圈顯著較大的僅為9株，分別為XL332-2，XL5-5，XL44，XL4-1，XL44-1，XL2-3，XL5-3，XL2-1 和XL4-3。

只有極少數(shù)的3株乳酸菌菌株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌幾乎沒(méi)有效果，分別為 XL3，XL5，XL11。

大多數(shù)菌株只能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌其中的一種。如XL22-1抑制革蘭氏陰性菌的抑菌圈達(dá)到了7.06，而抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌圈大小僅為6.00。

綜合以上考慮選取了不僅發(fā)酵液抑菌效果好而且排除酸影響后抑菌效果好的菌株，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都有抑菌效果的XL44，XL332-2，XL5-5，XL44，XL4-1，XL44-1，XL2-3，XL5-3，XL2-1和XL4-3這9株菌做發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

從這9株菌株中做抑菌圈大小的比較，可以看出XL332-2和XL44-1在排除酸影響后對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的抑菌圈大小均比其他菌株要大且達(dá)到6.8以上。在排除酸影響后抑菌效果仍然如此之強(qiáng)，推測(cè)可能是細(xì)菌素的作用，也就是我們要找的目標(biāo)菌株。這兩株菌株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都有抑菌作用，其抑菌譜很廣。

自發(fā)酵晾干成成品后至今，各個(gè)發(fā)酵棉粕的樣品在常溫下保存均未有腐敗現(xiàn)象發(fā)生。

3.3 發(fā)酵結(jié)果與分析

XL2-1的潛伏期較短，對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)快，且OD值是這幾株菌株中最大的。而XL5-5潛伏期長(zhǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)期所用的時(shí)間長(zhǎng)，最終的OD值最小。而篩選出的產(chǎn)細(xì)菌素較好的XL332-2和XL44-1兩株菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)與 XL44，XL4-1，XL2-3，XL5-3，XL4-3這5株菌株沒(méi)有顯著區(qū)別。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，各個(gè)菌株均在16h左右達(dá)到0D值的最大值，也就說(shuō)明了這9株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的最佳接種期為16h。其具體菌落數(shù)的結(jié)果如表5所示。

表 5 對(duì)數(shù)期菌落數(shù)的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后棉粕的各項(xiàng)具體指標(biāo)見(jiàn)表6。

表 6 發(fā)酵后各項(xiàng)指標(biāo)

發(fā)酵后指標(biāo)分析：

從粗纖維組來(lái)看，XL5-5對(duì)減少粗纖維含量效果較好，較空白組減少了14.43%。晾干前XL2-1的酸堿度最低，晾干后為6.23，酸堿度居中。從含水量來(lái)看，XL332-2總體來(lái)說(shuō)含水量較大。

從蛋白質(zhì)組來(lái)看，XL4-3對(duì)提高蛋白質(zhì)含量高于其他菌株，較空白組提高了4.68%,而較成品棉粕提高了0.9%。這說(shuō)明乳酸菌不僅能起到抑菌作用，對(duì)于提高飼料的蛋白質(zhì)含量也有一定的作用。

從脫酚率來(lái)看，XL5-5的效果最好，高達(dá)20.15%。

4 結(jié)論

經(jīng)過(guò)涂布培養(yǎng)、劃線(xiàn)培養(yǎng)，確定從河北五個(gè)市縣的青貯飼料中得到51株菌種，經(jīng)菌落及個(gè)體形態(tài)觀(guān)察、革蘭氏染色、及生理生化實(shí)驗(yàn)確定為乳酸菌。其中有 8株乳球菌，分別為 XL12，XL13，XL22，XL31，XL11-1，XL24，XL1-2，XL11-2，43株乳桿菌分別為 XL1，XL1-1，XL2，XL2-1，XL3，XL3-1，XL4，XL4-1，XL5，XL5-1，XL5-2，XL5-3，XL11，XL22-1，XL33，XL33-1，XL33-2，XL331-1，XL331-2，XL332-1，XL332-2，XL44，XL44-1，XL55，XL55-1，XL15，XL14，XL22，XL23，XL32，XL1-1，XL2-1，XL21，XL44，XL22-1，XL22-2，XL3-2，XL331-3，XL35，XL334-1，XL4-3，XL4-5，XL5-5。

通過(guò)對(duì)發(fā)酵液抑菌效果和排出酸影響后抑菌效果的分析，從分離出的51株乳酸菌中篩出9株抑菌性質(zhì)優(yōu)良的乳酸菌，分別是XL44，XL332-2，XL5-5，XL44，XL4-1，XL44-1，XL2-3，XL5-3，XL2-1和XL4-3，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌作用，其中XL332-2和XL44-1這兩株菌株的抑菌圈大小無(wú)論是在發(fā)酵液抑菌時(shí)的抑菌圈還是排出酸影響后的抑菌圈均比另外7株菌株的抑菌圈大。

綜上所述，XL332-2和XL44-1為我們所找的目標(biāo)菌，即產(chǎn)細(xì)菌素好的菌株。XL4-3提高蛋白質(zhì)的含量能高于發(fā)酵成品，說(shuō)明乳酸菌不僅抑菌能力強(qiáng)，而且能提高飼料中的蛋白質(zhì)含量，這也是本實(shí)驗(yàn)的新發(fā)現(xiàn)。