臨床就診犬布魯氏菌病血清學(xué)調(diào)查

陳金娟 天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系 300384

1 緒論

犬布魯氏菌病是由布魯氏菌侵入機(jī)體引起的傳染變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染病，國內(nèi)外均有犬感染該病的報(bào)道。

犬布魯氏菌病的檢測(cè)主要采用國際標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的虎紅平板凝集試驗(yàn) （RBPT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）[1]。這些方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。但由于試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，抗原、血清用量較大，試管、吸管反復(fù)刷洗，在標(biāo)本量大的布魯氏菌病監(jiān)測(cè)中很不方便，微量凝集試驗(yàn)也在不斷改革發(fā)展并日臻完善。微量凝集試驗(yàn)檢測(cè)布魯氏菌病抗體最早見于1988年的文獻(xiàn)，方堅(jiān)勇等用96孔V型血凝板、12號(hào)去針尖頭接乳膠頭為移液器，進(jìn)行微量試管凝集試驗(yàn)，檢測(cè)牛布魯氏菌病抗體并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，得出微量法和試管法的檢出率準(zhǔn)確性一致的結(jié)論[2-3]。

1.1 布魯氏菌

1.1.1 布魯氏菌簡(jiǎn)介

布魯氏菌又叫布氏桿菌，為革蘭氏陰性短小桿菌，初次分離時(shí)多呈球狀、球桿狀和卵圓形。專性需氧，但許多菌株，尤其是在初代分離培養(yǎng)時(shí)尚需5%～10%的二氧化碳。最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適pH為6.6～7.4。該菌傳代培養(yǎng)后漸呈短小桿狀，菌體無鞭毛，不形成芽胞，毒力菌株可有菲薄的莢膜。1985年世界衛(wèi)生組織(WHO)布魯氏菌病專家委員會(huì)將布魯氏菌屬分為6個(gè)種19個(gè)生物型 [4]，即羊種（生物型 1～3），牛種（生物型 1～7.9），豬種（生物型1～5）及綿羊型副睪種，沙林鼠種，犬種（各1個(gè)生物型）。我國已分離到羊種、牛種、豬種、綿羊型副睪種和犬種各1個(gè)型。臨床上以羊、牛、豬3種易感性最強(qiáng)，羊種致病力最強(qiáng)。

1.1.2 流行情況

布魯氏菌可引致多種動(dòng)物和人的布魯氏菌病，細(xì)菌可經(jīng)氣溶膠傳播，是潛在的生物武器。一年四季均可發(fā)病，流行區(qū)在發(fā)病高峰季節(jié)（春末夏初）可呈點(diǎn)狀暴發(fā)。常呈地方性流行。病畜主要通過流產(chǎn)物、精液和乳汁排菌，污染環(huán)境。羊、牛、豬的易感性最強(qiáng)。母畜比公畜，成年畜比幼畜發(fā)病多。帶菌動(dòng)物尤其是病畜的流產(chǎn)胎兒、胎衣是主要傳染源。以感染羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌最為嚴(yán)重。

本病流行于世界各地，我國多見于東北、西北等牧區(qū)。該病于20世紀(jì)50～60年代在中國有較嚴(yán)重流行，到20世紀(jì)90年代下降為0.01%。然而從1993年起布魯氏菌病疫情出現(xiàn)了反彈，人間布魯氏菌病疫情回升幅度較大，畜間布魯氏菌病也呈上升情況。2003～2005年，農(nóng)業(yè)部對(duì)12個(gè)省市部分奶牛場(chǎng)的4108份乳樣進(jìn)行布魯氏菌病檢測(cè)，從10個(gè)省檢出203份陽性乳樣，陽性率達(dá)4.94%。

1.1.3 布魯氏菌病的防控

我國推廣"檢疫、免疫、捕殺病畜"的綜合性防治措施，同時(shí)針對(duì)疾病流行的3個(gè)環(huán)節(jié)采取相應(yīng)措施：非疫區(qū)以監(jiān)測(cè)為主；穩(wěn)定控制區(qū)以監(jiān)測(cè)凈化為主；控制區(qū)和疫區(qū)實(shí)行監(jiān)測(cè)、撲殺和免疫相結(jié)合的方法。

免疫接種：疫情呈地方性流行的區(qū)域，應(yīng)采取免疫接種的方法。免疫接種范圍內(nèi)的牛、羊、豬、鹿等易感動(dòng)物。根據(jù)當(dāng)?shù)匾咔?，確定免疫對(duì)象。

檢疫：異地調(diào)運(yùn)的動(dòng)物，必須來自于非疫區(qū)，應(yīng)憑當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)出具的檢疫合格證明調(diào)運(yùn)。動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)要對(duì)調(diào)運(yùn)的種用、乳用、役用動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。檢測(cè)合格后，方可出具檢疫合格證明。調(diào)入后應(yīng)隔離飼養(yǎng)30d，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢疫合格后，方可解除隔離。

人員防護(hù)：飼養(yǎng)員每年要定期進(jìn)行健康檢查。發(fā)現(xiàn)患有布魯氏菌病的應(yīng)調(diào)離崗位，及時(shí)治療。

防疫監(jiān)督：布魯氏菌病監(jiān)測(cè)合格，應(yīng)為奶牛場(chǎng)、種畜場(chǎng)發(fā)放《動(dòng)物防疫合格證》或?qū)忩?yàn)合格的證明。動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)要加強(qiáng)轄區(qū)內(nèi)奶牛場(chǎng)、種畜場(chǎng)的檢疫凈化情況的監(jiān)督檢查。鮮奶收購點(diǎn)（站）必須憑奶牛健康證明收購鮮奶。

1.2 布魯氏菌病的檢測(cè)方法

布魯氏菌病常表現(xiàn)為慢性或隱性感染，其診斷和檢疫主要依靠血清學(xué)檢查及變態(tài)反應(yīng)。目前血清學(xué)檢查是診斷布魯氏菌病的常用方法[5-8]，主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。

1.2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)

此法簡(jiǎn)便，快速易行，比較敏感，適合于現(xiàn)場(chǎng)大批檢疫時(shí)做篩選檢查。但該法具有一定的假陽性，所以不宜做最后診斷。

1.2.2 試管凝集試驗(yàn)

試管凝集試驗(yàn)自Wright建立以來一直是各國診斷布魯氏菌病的常規(guī)血清學(xué)診斷方法，在布魯氏菌病的檢測(cè)和控制規(guī)劃中發(fā)揮了巨大的作用。試管凝集試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，判定容易，有廣闊的應(yīng)用前景，我國將其列為動(dòng)物布魯氏菌病診斷的國家標(biāo)準(zhǔn)。然而，《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646～2002)規(guī)定的方法是早些年根據(jù)當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備條件建立的，隨著實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備的發(fā)展與更新，近年來認(rèn)為試管凝集試驗(yàn)可以改進(jìn)為微量法在96孔微量板上操作[9]，而且比傳統(tǒng)的試管凝集試驗(yàn)具有許多優(yōu)點(diǎn)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

用ELISA檢測(cè)標(biāo)本中的抗原或抗體是20世紀(jì)70年代初創(chuàng)立的一項(xiàng)技術(shù)，主要有間接ELISA試驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)。該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、測(cè)定成本低等優(yōu)點(diǎn)，將酶聯(lián)反應(yīng)的高效性與免疫反應(yīng)的特異性、高度專一性有機(jī)結(jié)合成為具有推廣應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)[10]。Cav-leson等(1976)首次應(yīng)用ELISA檢測(cè)牛布魯氏菌病抗體并發(fā)現(xiàn)其敏感性比試管凝集試驗(yàn)高10～100倍。谷登峰等(1989)建立了一種 Dot-ELISA和單克隆抗體相結(jié)合的檢測(cè)方法，對(duì)10頭健康牛和2個(gè)可疑奶牛場(chǎng)的15份奶牛血清進(jìn)行快速診斷，結(jié)果在傳統(tǒng)的試管凝集試驗(yàn)均為陰性的情況下，ELISA陽性率為14.78%。證明該方法具有特異、敏感、實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)研究的目的、方法及預(yù)期目標(biāo)

布魯氏菌病是我國乙類傳染病。布魯氏菌病主要侵害機(jī)體淋巴系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，家畜患病后可以發(fā)生胎膜發(fā)炎、不孕、不育、流產(chǎn)、睪丸炎、乳腺炎以及各種組織病變等。人感染后主要表現(xiàn)為波狀熱、多汗、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛及肝、脾腫大、關(guān)節(jié)變形等，病程較長(zhǎng)且易復(fù)發(fā)。該病廣泛分布于世界各地尤其是畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)。據(jù)調(diào)查，全世界200多個(gè)國家和地區(qū)中已有170多個(gè)存在布魯氏菌病疫情，每年造成的損失高達(dá)數(shù)百億美元[11]。

2 試驗(yàn)材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

收集100只前來天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院就診的、需靜脈采血檢驗(yàn)的臨床犬的血樣。

2.1.1 主要儀器

移液器：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司Y91921 20-200μl

北京雷勃爾離心機(jī)有限公司 Y74797 10-100μl

北京雷勃爾離心機(jī)有限公司 Y73441 100-1000μl

離心機(jī)：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司 LZD 5-D

2.1.2 主要試劑

苯酚：天津市永大化學(xué)試劑有限公司 批號(hào)：Z0110418

氯化鈉注射液（0.9%：吉林科倫康奈爾制藥有限公司 批號(hào)：S070737HZ

犬布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 批號(hào)：201001

犬布魯氏菌病高免血清：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所批號(hào)：2011-3

犬布魯氏菌病陽性血清：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所批號(hào)：2009-1

2.1.3 其他器械用品

酒精棉球、無齒鑷子、2ml注射器、橡膠管、一次性使用塑料試管滴管、移液器槍頭、載玻片、牙簽、恒溫箱、顯微鏡。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 樣品采取

對(duì)來天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院檢驗(yàn)室抽血化驗(yàn)的臨床就診犬利用無菌操作采集靜脈血 （2～2.5ml），詢問畜主患病犬的主要癥狀、年齡、性別、品種、繁育史并對(duì)收集的血樣進(jìn)行編號(hào)，將數(shù)據(jù)記錄于登記表。采集的血樣立即用離心機(jī)（3600r/min 2～3min）離心，吸取上層血清，-20°C冷凍保存。

2.2.2 虎紅平板凝集試驗(yàn)

待測(cè)血清預(yù)處理：將冷凍過的待測(cè)血清放入恒溫箱內(nèi)10min左右，使其解凍。

虎紅平板凝集試驗(yàn)操作方法：用微量移液器分別取2滴犬布魯氏菌病虎紅平板凝集陽性抗原于載玻片上，再分別取犬布魯氏菌病陽性血清、犬布魯氏菌病陰性血清各1滴與上述抗原混合，并用牙簽攪拌均勻（見圖1）。于另一塊載玻片上分別取3滴犬布魯氏菌病虎紅平板凝集陽性抗原，將編號(hào)為001、002、003的待測(cè)血清各1滴與上述抗原混合，用牙簽攪拌均勻，3-5min內(nèi)觀察結(jié)果（見圖2）。以此類推，繼續(xù)進(jìn)行編號(hào)004～100的待測(cè)血清的試驗(yàn)。

虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果判定：在陽性血清與陽性抗原出現(xiàn)明顯凝集顆粒，陰性血清與陽性抗原之間仍均勻渾濁的前提下，待測(cè)血清如與陽性抗原出現(xiàn)明顯凝集顆粒，則判為陽性；如均勻渾濁，則判為陰性；介于二者之間則為可疑。

2.2.3 微量凝集試驗(yàn)

對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)呈陽性或可疑的血清抗體進(jìn)行定量檢測(cè)。

血清的稀釋和加入抗原：準(zhǔn)備好96孔板。第一孔加入115μl石炭酸生理鹽水，第二孔不加，第三、四、五管各加入20μl，第六、七孔不加，第八孔加20μl。其中第六、七、八孔分別是陰性血清（Abˉ）、陽性血清（Ab＋）、抗原對(duì)照組。用移液器吸四孔中吸取20μl加入第五孔，第五孔混勻后棄去20μl。第六、七管分別加入20μl待測(cè)血清，第八孔不加。這樣從第二孔到第五孔血清稀釋度分別為1∶25、1∶50、1∶100、1∶200。血清稀釋后即可加入抗原。每孔加入20μl陽性抗原，震蕩均勻。見表 1。

記錄結(jié)果：將96孔板充分震蕩后置于37°C～38°C恒溫箱中恒溫30min，觀察并記錄結(jié)果。

微量凝集試驗(yàn)結(jié)果判定：根據(jù)各孔中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集塊的形狀，來判定凝集反應(yīng)的程度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果∶陽性血清0份（0/100）,可疑血清 5 份（5/100），陰性血清 95 份。

3.2 微量凝集試驗(yàn)結(jié)果∶陽性血清0份（0/100）,可疑血清0份（0/100），陰性血清100份。

表 2 虎紅平板凝集和微量凝集試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

4.1 對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)和微量凝集試驗(yàn)結(jié)果的分析

在100份臨床就診犬血清中，應(yīng)用虎紅平板凝集試驗(yàn)測(cè)得可疑率為5%，而微量凝集試驗(yàn)則無可疑病例，由此可以從側(cè)面反映出微量凝集試驗(yàn)與虎紅平板凝集試驗(yàn)相比具有較好的敏感性和特異性。利用顯微鏡觀察試驗(yàn)結(jié)果，就免去了人為主觀因素的影響，對(duì)結(jié)果的判斷更為準(zhǔn)確和客觀。

4.2 關(guān)于虎紅平板凝集試驗(yàn)的準(zhǔn)確性

布魯氏菌誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生最多的抗體是IgG1，其次為IgM抗體，虎紅平板凝集試驗(yàn)和微量凝集試驗(yàn)檢測(cè)的主要是IgM抗體，容易受到動(dòng)物體內(nèi)其它IgM抗體的干擾?；⒓t平板凝集試驗(yàn)特異性不高，受試驗(yàn)溫度、凝集時(shí)間相對(duì)較短和人為主觀因素的影響，不易準(zhǔn)確判定結(jié)果。

4.3 關(guān)于微量凝集試驗(yàn)的準(zhǔn)確性

微量凝集試驗(yàn)是我國布魯氏菌病的法定檢測(cè)判定方法，但是該方法由于操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，不適于在牛、羊飼養(yǎng)場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)采用。而本實(shí)驗(yàn)采用的微量凝集試驗(yàn)在等比例減少了試驗(yàn)中各試劑的量之后，可以在一定程度上縮短反應(yīng)時(shí)間。

5 結(jié)論

100 只隨機(jī)抽樣臨床就診犬的犬種布魯氏菌感染率為0；微量凝集試驗(yàn)借助顯微鏡來觀察結(jié)果，可減小因肉眼觀察帶來的試驗(yàn)誤差，提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

［1］國家技術(shù)監(jiān)督局，中華人民共和國衛(wèi)生部.GB15988-1995布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則［S］.1995.

［2］衛(wèi)生部政策法規(guī)司.WS269-2007.布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

［3］方堅(jiān)勇，劉勝紅.用微量試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)布魯氏菌病抗體的研究［J］畜牧獸醫(yī)，1998，39（3）：131.

［4］吳清民.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：187～193.

［5］ Morgan WJB，MacKinnon DJ，Lawson JR，et al.The rose bengalplate agglutination test in the diagnosis of brucellosis［J］.VetRec，1969，85(23):636～641.

［6］ Nicoletti P.An evaluation of serologic tests used to diagnose.Brucellosis in buffaloes(Bubalus bubalis)［J］.Trop Anim Health Prod，1992，24(1):40～44.

［7］ Mateu deAntonio EM，Martín M，CasalJ.Comparison of serologictests used in canine brucellosis diagnosis［J］.J Vet DiagnInvest，1994，6(2):257～259.

［8］宋翠平，徐輝，王志亮，等.檢測(cè)布魯氏菌病的四種血清學(xué)方法比較及國際標(biāo)準(zhǔn)單位的應(yīng)用［J］.中國動(dòng)物檢疫，2003，20（2）:25～27.

［9］世界動(dòng)物衛(wèi)生組織,陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)(哺乳動(dòng)物、禽鳥與蜜蜂)［M］.農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局/中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心譯.第五版.2007.

[10] Barbro S，Wilfried K，Uwe T.A simple touch-downpolymerasechain reaction for the detection of canineparvorvirus and Feline panleukopenia Virus in feces.[J].Journal of Virological Methods，1995，55:427-433.

［11］Gul ST，Khan A.Epidemiology and epizootology ofbrucellosis:a review ［J］.Palostam Vet.J.2007，27(3):145～151.