大腸桿菌在原子力顯微鏡下的觀測及其形貌

楊 浩，宋 濤，趙慧平，呂 中，陳 嶸

(武漢工程大學綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北省新型反應(yīng)器與綠色化學工藝重點實驗室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

自從Binnig等[1]在1986年發(fā)明原子力顯微鏡(AFM)以后，AFM已逐漸成為生物學領(lǐng)域的重要的研究工具之一，并被廣泛應(yīng)用于分析各種生物細胞[2-4].AFM能夠提供納米級別的表面形貌信息，可在空氣或液體中直接對樣品進行檢測，避免了樣品的染色和超真空條件[5-6].同時，AFM在液相中可對細胞的生長和分裂進行實時動態(tài)的監(jiān)控[7].AFM技術(shù)已被廣泛用于檢測生物細胞的機械性[8-9]、粘附性[10-11]、疏水性[12]、靜電力[13]等性質(zhì)及其免疫學研究[14].

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，簡稱大腸桿菌，為革蘭氏陰性菌.大腸桿菌在自然界中分布廣泛，大多數(shù)是不致病的，但有些侵入人體時可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等，因此大腸桿菌被認為是一種條件致病菌.大腸桿菌是現(xiàn)代生物學中研究最多的一種細菌，作為一種模式細菌，大腸桿菌常被用來衡量抗菌劑的抗菌效果[15-17]，而通過AFM對大腸桿菌表面微觀結(jié)構(gòu)的觀測則有利于理解抗菌劑對細菌的作用機理[18].

雖然AFM可用于觀測生物細胞的微觀結(jié)構(gòu)，但若操作不當或參數(shù)設(shè)置不合理，則很有可能得不到清晰的圖像或產(chǎn)生假圖.本研究中，對影響大腸桿菌AFM圖像質(zhì)量的主要因素進行了探討，并分析大腸桿菌細胞表面的形貌參數(shù).

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(CCTCC AB 90054)，由華中師范大學生命科學學院提供.將大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，150 r/min下震蕩培養(yǎng)24 h，然后取一定量的原始菌液，稀釋至OD660值為0.068～0.075.

實驗儀器采用美國Veeco公司生產(chǎn)的Multimode型AFM.掃描采用RTESP型硅探針(Veeco)，共振頻率為235～287 kHz，彈性指數(shù)為20～80 N/m，針尖曲率半徑8 nm，正面角(15±2)°.

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 采用蓋玻片作為AFM測試的基底.蓋玻片分別經(jīng)丙酮和無水乙醇超聲清洗10 min，然后浸泡在無水乙醇中待用.由于微生物細胞具有生物活性，且細胞表面柔軟，與AFM探針作用力較小時會得不到清晰的圖像，因此在測量前需將細胞固定.固定前先用氮氣將蓋玻片表面吹干，然后用PBS緩沖液將菌液沖洗兩次，在室溫下加入質(zhì)量分數(shù)2.5%的戊二醛PBS溶液，固定15 min.最后，移取20 μL的菌液滴在蓋玻片上，自然晾干.

1.2.2 AFM測量 采用輕敲模式在空氣中對大腸桿菌進行掃描，掃描范圍為5 μm×5 μm，在此范圍內(nèi)可觀察到十幾到二十幾個大腸桿菌細胞.記錄AFM振幅(amplitude)圖和高度(height)圖.振幅圖用來定性分析細胞表面特征，它比高度圖更能直接觀測到表面微觀結(jié)構(gòu)；高度圖反映細胞的形貌，并用來定量分析大腸桿菌表面形貌參數(shù)，包括細胞的長度、寬度和高度.所有的圖像和分析通過AFM自帶的軟件Nanoscope IIIa(版本號5.31r1)進行處理.大腸桿菌表面形貌參數(shù)的測定是通過對15個細菌的長、寬、高數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 AFM掃描參數(shù)的確定

2.1.1 分辨率 分辨率的大小決定了AFM圖像清晰度.圖1是掃描頻率為2 Hz，setpoint值為1.645 V，I/P值為0.6/0.7時，改變分辨率所得到的AFM振幅圖.從圖中可知，隨著分辨率的增加，圖像越清晰，圖中所反映的表面細節(jié)越多，但當分辨率達到512時，細胞邊界開始出現(xiàn)明顯的條紋(圖1c).這可能是因為分辨率的提高增大了探針與細胞間的作用力，而細胞較軟，具有一定的粘附性，導(dǎo)致探針在掃描到細胞表面時發(fā)生了振蕩.因而選擇分辨為256較為適宜，此時可較清晰地觀察到細胞的表面形貌和輪廓，細胞中間出現(xiàn)的裂痕說明細菌正處在分裂狀態(tài).

圖1 大腸桿菌在不同分辨率下的AFM振幅圖.Fig.1 AFM amplitude images of Escherichia coli under different resolutions注： a, b, c 分辨率分別為128, 256和512.

2.1.2 掃描頻率 在圖像不失真的前提下適當提高掃描速度可節(jié)省大量時間，而掃描速度主要取決于掃描頻率和掃描范圍.例如當掃描范圍為5 μm×5 μm，掃描頻率為2時，這時掃描速度為20 m/s.圖2是分辨率為256，setpoint值為1.645 V，I/P值為0.6/0.7時，改變掃描頻率所得到的AFM振幅圖.對比圖1b發(fā)現(xiàn)，當掃描頻率減小時圖像變得模糊，質(zhì)量不佳(圖2a)，而當掃描頻率增大時由于探針快速移動而來不及響應(yīng)反饋信息，圖像出現(xiàn)明顯波動，表面輪廓分辨不清(圖2b).因此掃描頻率定為2 Hz較適宜.

圖2 大腸桿菌在不同掃描頻率下的AFM振幅圖.Fig.2 AFM amplitude images of Escherichia coli under different scanning frequencies注： a, b的頻率分別為1 Hz 和3 Hz.

2.1.3 setpoint值 setpoint值表示探針與樣品間作用力的大小.在輕敲模式中，當setpoint值增加時探針與樣品的作用力會減小，而當setpoint值減小時探針與樣品的作用力會增大.圖3是分辨率為256，掃描頻率為2 Hz，I/P值為0.6/0.7時，改變setpoint值所得到的AFM振幅圖.由圖可知，當setpoint值從1.645降至1.425時，圖像沒有發(fā)生明顯變化，但如果setpoint值過小，探針會劃傷細胞表面，甚至會損壞探針.因此，在不影響圖像質(zhì)量的前提下setpoint值應(yīng)盡可能增大.而當setpoint值增加到1.813時，在圖3b左側(cè)較高的地方出現(xiàn)了幾處跳針，并且繼續(xù)增加setpoint值，AFM圖像開始出現(xiàn)明顯的失真，trace和retrace曲線不重合，得不到真實的表面形貌.因此，本實驗的setpoint值定為1.645.

2.1.4I/P值I值(Integra1 gain，積分增益)和P值(Proportion gain，比例增益)主要用于設(shè)定探針對樣品表面的跟蹤反饋能力.I值比P值敏感，P值一般隨I值而定，通常在數(shù)值上比I值大20%.圖4是分辨率為256，掃描頻率為2 Hz，setpoint值為1.645時，改變I/P值所得到的AFM振幅圖.從圖中可以看出，當I/P值在0.9/1.0時，圖像出現(xiàn)很多干擾條紋，界面模糊不清，質(zhì)量較差(圖4b)；而當I/P值在0.3/0.4時，圖像變得十分清晰，細胞表面形貌和邊界較為明顯，與圖1b相比，表面上的一些條紋也消失不見(圖4a).因此，最佳的I/P值為0.3/0.4.

圖3 大腸桿菌在不同setpoint值下的AFM振幅圖.Fig.3 AFM amplitude images of Escherichia coli under different setpoints注： a, b的setpoint值分別為1.425和1.813.

圖4 大腸桿菌在不同I/P值下的AFM振幅圖.Fig.4 AFM amplitude images of Escherichia coli under different I/P gains.注： a, b的I/P值分別為0.3/0.4和0.9/1.0.

2.2 大腸桿菌形貌分析

在確定好最佳的AFM掃描參數(shù)后，隨機選取了一塊5 μm×5 μm的掃描范圍，記錄下樣品的AFM高度圖，如圖5a.在此范圍內(nèi)選取15個大腸桿菌，統(tǒng)計分析它們的長度、寬度和高度，分別得到圖5b、5c和5d.結(jié)果表明，大腸桿菌的長度為(985.2±76.8)nm，寬度為(751.5±74.7)nm，高度為(168.4±39.3)nm，與以往的文獻報道相近[19-21].這說明采用本實驗所用的掃描方法可準確測量大腸桿菌的形貌特征參數(shù).

圖5 大腸桿菌AFM高度圖(a)及表面形貌分析.Fig.5 AFM Height image of Escherichia coli (a) and surface morphology analysis.注： b, c, d分別是大腸桿菌的長度、寬度和高度的統(tǒng)計分析結(jié)果.

3 結(jié) 語

通過比較不同掃描參數(shù)下的振幅圖，得到AFM對大腸桿菌掃描的最佳參數(shù)為：分辨率為256，掃描頻率為2 Hz，setpoint值為1.645 V，I/P值為0.3/0.4.本實驗所得到的大腸桿菌長度為(985.2±76.8)nm，寬度為(751.5±74.7)nm，高度為(168.4±39.3)nm，與文獻報道相近.這些參數(shù)的準確獲取為進一步研究微生物的生理變化以及抗菌劑的作用機理提供了先決條件.

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