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    桿狀病毒在氣升式反應器中感染策略優(yōu)化

    2012-06-11 07:10:26張佑紅徐智鵬蘇騰甲
    武漢工程大學學報 2012年6期

    張佑紅,楊 文,危 威,徐智鵬,蘇騰甲

    (武漢工程大學化工與制藥學院,綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室,湖北 武漢 430074)

    0 引 言

    利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)進行重組蛋白、疫苗和生物殺蟲劑的大規(guī)模生產越來越受到人們的重視[1],因此需要對其生產過程進行優(yōu)化.近年來,人們主要在以下幾個方面進行了優(yōu)化:a.細胞生長情況[2];b.培養(yǎng)基[3-4];c.溶氧;d.反應器的設計[5];e.感染策略[6-9],其中包括感染復數(MOI)、感染時間 (TOI)、細胞初始濃度(ICD)和培養(yǎng)基的替換.利用高感染復數進行重組蛋白和病毒殺蟲劑的生產過程已經很清楚,在高感染復數條件下,所有細胞都“同步”感染[10].但在實際生產中,采用低感染復數有以下優(yōu)點[11]:a.可以大大減少病毒原種的用量,無需大量擴增培養(yǎng),從而減少設備投資, 縮短工藝流程,降低生產中受污染的概率;b.減少了由于高復數感染引起的“傳代效應”.而且據相關報道, 在高感染復數下獲得的重組蛋白的產量比低感染復數下低.因此,低感染復數下桿狀病毒感染昆蟲細胞的研究日益受到重視.本研究將在氣升式反應器中對感染策略的4個方面 (不包括培養(yǎng)基的替換): MOI、TOI、ICD和DO 進行優(yōu)化.研究感染策略的文獻一般只考察單因素對昆蟲細胞-桿狀病毒表達體系的影響.本研究將采用正交實驗來進行感染策略的優(yōu)化,這種方法的優(yōu)點是它不僅考慮了單因素對昆蟲細胞桿狀病毒表達體系的影響,而且考慮到了各個因素間的相互影響.這樣得到的結果對實際生產有更大的參考價值.

    1 實驗部分

    1.1 實驗材料

    1.1.1 培養(yǎng)基 Grace 培養(yǎng)基 (GBICO公司)、胎牛血清(GBICO公司)、酵母提取物及脂類復合物 (GBICO公司)、Pluronic F-68(GBICO公司).培養(yǎng)基組成: Grace 培養(yǎng)基,5%(體積分數,下同)的胎牛血清,1% 的酵母提取物,1.5% 的脂類復合物,0.1%的 Pluronic F-68.貼壁培養(yǎng)、搖瓶懸浮培養(yǎng)和氣升式反應器培養(yǎng)的培養(yǎng)基相同.

    1.1.2 細胞、病毒及其計數 棉鈴蟲細胞HzAM1由中國科學院武漢病毒所提供的美洲棉鈴蟲細胞系.將棉鈴蟲細胞HzAM1在含體積分數5%(正常的情況是10% )胎牛血清的Grace 培養(yǎng)基于 27 ℃下恒溫培養(yǎng).將細胞用質量分數0.4%臺盼藍染色后用血球計數板計數,計算活細胞濃度及細胞存活率.棉鈴蟲病毒 [ Helicoverp a armiger a single nucleocapsid nucleopolyhedro virus(HaSNPV )]由中國科學院武漢病毒所的王華林教授提供,由該所構建提供的棉鈴蟲病毒(HaBacHZ8-eGPF-PH)帶有綠色熒光蛋白(eGFP).包涵體病毒濃度利用血球計數板在高倍顯微鏡下計數,使用流式細胞儀測定非包涵體病毒滴度[12].

    1.2 儀器與設備

    1.2.1 常規(guī)儀器 2001 型振蕩慍溫培養(yǎng)箱(常州國華電器有限公司),熒光顯微鏡(Olympus BX-51),倒立式顯微鏡(XDS-1B ),流式細胞儀(BD公司) 超低溫冰箱(New Brunswick Scientific),無油空氣壓縮機(揚州市恒順機械廠),氧氣瓶、氮氣瓶(青島華青集團有限公司),pH 探頭、氧探頭(Broadley James 公司),其他均為實驗室常規(guī)儀器.

    1.2.2 氣升式反應器 本實驗室設計的氣升式反應器總體積570 mL,有效體積500 mL.配備有一個溶氧探頭和一個pH探頭,中間有4根金屬導管,它們的作用分別是通氣、取樣、放氣和加料.通氣導管從容器底部通入無菌的空氣、氧氣和氮氣,它的作用主要有兩個:通入的氣體推動溶液在反應器中循環(huán)流動,使細胞懸浮生長;通過空氣、氧氣和氮氣的比例來調節(jié)溶氧的大小.通過計算機自動控制反應器中的溶氧值和pH值.

    1.3 實驗方法

    將生長良好的細胞接種在100 mL的搖瓶中在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng).其中接種體積為25 mL,培養(yǎng)溫度為27 ℃,轉速為80 r·min-1.每12 h取樣在血細胞計數板上測定細胞濃度,待細胞濃度達到實驗要求后轉入氣升式反應器中培養(yǎng).本實驗設計了正交實驗,四因素為感染復數、感染時間、細胞初始濃度和溶氧值.每個因素設計了3個水平.正交實驗水平見表1.

    表1 正交實驗因素與水平

    其中ICD為細胞接種氣升式反應器時的細胞濃度,而不是細胞被感染時的細胞濃度.TOI為細胞處于對數生長期的初期、中期、晚期.

    根據以上的正交表,一共進行了9組實驗,細胞接種氣升式反應器后,每24 h采樣測定活細胞濃度及細胞存活率,接種病毒后,每6 h采樣測定BV滴度和OV濃度.

    2 結果與分析

    2.1 數據分析

    圖1 不同細胞初始濃度下的BV病毒滴度Fig.1 Evolution of minus logarithm of TCID50 under different ICDs

    圖2 不同細胞初始濃度下的OV病毒濃度Fig.2 Evolution of amount of OVs under different ICDs

    編號ICD(A)/(105 cells·mL-1)MOI(B)TOI(C)DO(D)BVmax/(105 TCID50·mL-1)OVmax/(104 OVs·mL-1)111115.011282122212.59138313333.16124421233.981285223179.431686231225.1214073132101348321315.851469332125.12152k16.926.3315.3336.52k236.1835.9613.915.9k31717.830.867.66R29.2629.6316.9628.86k′1130130140149.3k′2147.3150.7139.3137.3k′3144132.7142132.7R′17.320.72.716.6

    2.2 ICD、MOI、TOI和DO對BV和OV滴度的影響

    3 結 語

    本研究是針對低感染復數下昆蟲細胞-桿狀病毒表達體系在氣升式反應器中的感染策略優(yōu)化,對BVs和OVs產量的影響考察了4個因素:MOI、ICD、DO和TOI.采用正交實驗來選擇最佳感染條件,結果表明MOI對BVs和OVs產量影響最大,ICD次之,DO次之,TOI對BVs和OVs影響最??;最佳感染條件為:MOI為0.1,ICD為2×105cells·mL-1,DO為10%,TOI為細胞生長對數期晚期,得到了較高的BV滴度為7.943×106TCID50·mL-1.但是本研究并沒有在更低的DO環(huán)境下優(yōu)化,而在低感染復數下細胞處于對數生長期初期對病毒的產量有更好的感染循環(huán).因此在下一步的工作中,可以在低DO、TOI為細胞生長對數期初期進行優(yōu)化,可能獲得更高的BV滴度和OV濃度.此外,本研究討論了MOI、ICD、DO和TOI的相互關系及對病毒產量的影響.這為昆蟲病毒殺蟲劑的大規(guī)模生產提供了一定的根據.

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