飼用酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸的同步測定

索德成 李蘭 樊霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

飼用酸化劑是指能夠酸化飼料的一類物質(zhì)。最初應(yīng)用酸化劑僅作為改善飼料適口性的一種風(fēng)味添加劑。隨著科學(xué)的發(fā)展，人們更深認(rèn)識到飼用酸化劑不僅可改善消化道pH值環(huán)境，保障動物有良好的消化環(huán)境，還能使飼料各組分在體內(nèi)被充分消化吸收，保證有益菌群合理生長，病原微生物受到有效抑制，從而達(dá)到提高動物生長性能和飼料利用率、增強(qiáng)機(jī)體抗病能力的效果[1-3]。近幾十年來，隨著公眾對飼用抗生素危害意識的提高，停用或減少抗生素作促生長劑的使用已成為必然的趨勢。酸化劑被視為在豬飼料中能有效替代抗生素的產(chǎn)品之一，在動物飼養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用[4]。目前酸化劑不僅應(yīng)用在仔豬生產(chǎn)中，在家禽、反芻動物上也有積極的效果。

市場也出現(xiàn)了各種類型的酸化劑。為了更好的掌握飼料酸化劑的產(chǎn)品質(zhì)量和其中有機(jī)酸的含量，規(guī)范飼料酸化劑的生產(chǎn)和使用，需要建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的有機(jī)酸的檢測方法。國內(nèi)外報道的有機(jī)酸的檢測方法主要有電位滴定法、毛細(xì)管電泳法[5-6]、氣相色譜法[7-13]、液相色譜法[14-19]等。氣相色譜法適用于少量沸點較低的有機(jī)酸。測量高沸點的酸要用硅烷化試劑衍生樣品，方法繁瑣，操作比較復(fù)雜；對熱穩(wěn)定性差和含量極低的有機(jī)酸難以測定。高效液相色譜法具有分析范圍廣、分析速度快等優(yōu)點，在環(huán)境樣品、食品、飼料酸化劑等有機(jī)酸成分分析中均有應(yīng)用[14-19]。但對甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、丙酸的同步分離分析未見報道，本實驗建立了利用液相色譜同步測定飼料酸化劑中5種有機(jī)酸的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BP310S/310 g型分析天平(賽多利斯公司，德國)；超聲器(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn))；Aglinet 1100型高效液相色譜（美國 Aglinet公司）：帶有紫外檢測器；Grom-sil分析色譜柱：250 mm×4.0 mm，粒徑 5 μm(美國Grace公司生產(chǎn))；甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品:含量大于98%,購置于德國Dr.Ehrenstorfer公司；其他試劑均為分析純試劑，實驗用水為Mili-Q純化后的超純水（＞18 MΩ）；硅酸鈣載體由市場購得。

1.2 樣品前處理

稱取適量樣品0.3～1.0 g（根據(jù)樣品中各種酸的濃度）加入100 ml容量瓶中，加入2/3去離子水，超聲提取30 min，用水定容至刻度。過0.45 μm微孔濾膜，上高效液相色譜測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Grom－Sil柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；流動相：pH 值 2.5 磷酸水溶液；流速為 1.0 ml/min；檢測波長：210 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

影響有機(jī)酸分離效果主要在于色譜柱的選擇和流動相的選擇，我們選用了Supelco gel C－610H、Agient AQ、agela ASB C18、Grom－Sil等色譜柱作為分離柱、使用不同pH值的水溶液作為基本流動相條件摸索檢測有機(jī)酸的色譜條件。實驗中發(fā)現(xiàn)采用C18柱分離有機(jī)酸時，乳酸和乙酸的保留時間基本一致，無法分離。采用Grom－Sil能比較好的分離5種有機(jī)酸，因此選用了Grom－Sil柱來分離。

不同的pH值、溫度對有機(jī)酸的分離影響較大，pH值過高，會導(dǎo)致有機(jī)酸出峰過快，無法分離。pH值過低，保留增加，峰形較差，拖尾嚴(yán)重，丙酸和檸檬酸無法分離。在pH=2～2.5的磷酸溶液可使各種酸在色譜柱中達(dá)到完全分離，從而提高各組分的分離度和分離效率。色譜溫度對有機(jī)酸的分離有很大的影響與pH值基本相同，溫度過高會導(dǎo)致出峰重疊。最后確定流動相為pH值2.5磷酸水溶液，柱溫為30℃。在此條件下，各種有機(jī)酸達(dá)到了良好的分離，標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜

2.2 提取條件選擇

甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸均易溶于水，并且酸化劑成分比較簡單，大部分成分是有機(jī)酸和無機(jī)載體（或水）的混合物。因此提取液不需進(jìn)一步凈化，經(jīng)濾膜過濾后就可以上機(jī)測定。

2.3 線性方程和檢出限、定量限

配置濃度為10～500 μg/ml甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以上述條件進(jìn)行檢測，以峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性實驗結(jié)果見表1，可見各種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在10～500 μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 有機(jī)酸線性關(guān)系

在本實驗條件下,將標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)稀釋后進(jìn)行空白樣品的加標(biāo)回收,根據(jù)10倍噪音的峰響應(yīng)值、取樣量和進(jìn)樣量,得出方法的定量限，具體結(jié)果見表1。

2.4 回收率與精密度實驗

精密稱取空白硅酸鈣載體0.5 g于100 ml棕色量瓶中，添加不同量甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制成含1%、10%的樣品；精密稱取空白硅酸鈣載體0.5 g，分別添加甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制成含30%酸化劑；另取已知含量固體酸化劑0.3 g于100 ml棕色量瓶中，添加適量甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液使其添加濃度為1%、10%。每個樣品5個重復(fù)，按上述方法進(jìn)行檢測，測得回收率和變異系數(shù)結(jié)果見表2。可見在1%～30%添加水平，方法回收率均大于85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～9.9%。結(jié)果表明，該方法測定5種有機(jī)酸含量測定的準(zhǔn)確度和精密度均表現(xiàn)良好。

3 實際應(yīng)用

表2 添加回收率和精密度實驗結(jié)果

應(yīng)用建立的方法，對從市場上獲得已知含量的飼料酸化劑進(jìn)行測定，檢測結(jié)果見表3。該檢測結(jié)果表明：本方法能滿足對飼料酸化劑中甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、丙酸的檢測需求。

表3 已知含量的酸化劑實驗結(jié)果（%）

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