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    1個玉米高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)體HKT的生物信息學(xué)分析

    2012-06-08 07:54:18陳靚靚羅為桂
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年19期
    關(guān)鍵詞:膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)體信號肽

    陳靚靚,羅為桂,劉 清,蘇 益

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410128)

    植物 HKT(high-affinity K+transporter)是一類Na+(或K+)轉(zhuǎn)運(yùn)體或Na+-K+共轉(zhuǎn)運(yùn)體的總稱,與植物Na+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及耐鹽關(guān)系密切[1-3]。HKT與微生物的Trk/Ktr同源,它們共同組成了Trk/Ktr/HKT基因家族[4-5]。TaHKT1首先從小麥(Triticum aestivum L.)中分離[6],隨后在擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)、水稻(Oryza sativa L.)等植物中也發(fā)現(xiàn)了 HKT基因[7-8]。HKT由多個跨膜區(qū)和多個孔環(huán)(pore loop,P-loop)組成,基本結(jié)構(gòu)單元是MPM(Transmembrane segment,Pore,Transmembrane segment),植物HKT通常含有4個MPM結(jié)構(gòu)。第1個P-loop中關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)Gly/Ser影響離子滲透性[9]。HKT家族成員數(shù)量巨大,功能較復(fù)雜,到目前為止,對高等植物HKT的研究主要集中在擬南芥、水稻和小麥等少數(shù)物種中且涉及的成員較少,還未見研究玉米(Zeamay L.)HKT的相關(guān)報(bào)道。該研究利用各種生物信息學(xué)分析工具,將1個玉米中功能還未知的HKT蛋白序列(NP_001168576.1)初步命名為ZmHKT1;5,并分析其蛋白氨基酸序列,推測ZmHKT1;5蛋白的進(jìn)化位置、理化性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu),旨在為進(jìn)一步試驗(yàn)研究ZmHKT1;5轉(zhuǎn)運(yùn)體在玉米中的功能奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    以GenBank中檢索到的1個玉米中功能還未知的HKT蛋白序列(NP_001168576.1)為檢索序列,使用Blastp程序檢索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫,篩選獲得同源HKT轉(zhuǎn)運(yùn)體。

    1.2 方法

    1.2.1 分子進(jìn)化分析 采用ClustalX1.83[10-11]軟件進(jìn)行多重序列比對,將ClustalX比對結(jié)果導(dǎo)入PHYLIP3.69軟件包,用bootstrap程序生成隨機(jī)樣本,隨機(jī)樣本導(dǎo)入prodist程序計(jì)算距離矩陣,neighbor程序?qū)⒕嚯x矩陣轉(zhuǎn)換為N-J多重樹,使用consense程序匯總所得多重樹得到嚴(yán)格一致樹,最后將進(jìn)化樹文件導(dǎo)入MEGA5.05繪制進(jìn)化樹。

    1.2.2 蛋白質(zhì)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析 采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì);以BioEdit7.01程序中Hphob./Kyte&Doolittle標(biāo)度進(jìn)行疏水性分析;以SignalP4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號肽預(yù)測;以SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測;以 PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;以Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htm l/page.cgi?id=index)進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ZmHKT1;5分子進(jìn)化分析

    2.1.1 多重序列比對 根據(jù)第1個P-loop過濾器(filter)上關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的不同可將植物HKTs分成兩個亞家族[4]。亞類I:第1個P-Loop中關(guān)鍵位點(diǎn)為絲氨酸,通常情況下這類HKT對Na+具有特異選擇性,所有單子葉和雙子葉植物中都含有該類轉(zhuǎn)運(yùn)體[2,12]。亞類II:第1個P-loop中關(guān)鍵位點(diǎn)為甘氨酸,這類轉(zhuǎn)運(yùn)體具有K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)特性[8-9],該亞家族成員只出現(xiàn)在單子葉植物中,但是水稻OsHKT2;1依然為絲氨酸特性[13]。已有研究表明,HKT家族轉(zhuǎn)運(yùn)體在植物耐鹽和調(diào)節(jié)體內(nèi)的Na+/K+平衡中發(fā)揮了重要作用[14-15]。利用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多重序列比對,截取HKT類蛋白的4個P-loop區(qū)中高度保守的特征性的氨基酸位點(diǎn)多為甘氨酸(G),ZmHKT1;5蛋白第 1個 P-loop中含有絲氨酸,屬于亞家族I。

    2.1.2 蛋白質(zhì)分子進(jìn)化分析 進(jìn)化樹分析及聚類結(jié)果如圖1所示,在HKT蛋白家族中與ZmHKT1;5 關(guān)系較近的轉(zhuǎn)運(yùn)體有 OsHKT1;5、HvHKT1;5、TaHKT1;5等,預(yù)示著在功能上ZmHKT1;5蛋白可能與這些蛋白最為接近,因此將該HKT歸為亞家族I并命名為ZmHKT1;5是合理的。

    2.2 ZmHKT1;5性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析預(yù)測

    圖1 ZmHKT1;5蛋白及其同源蛋白的進(jìn)化樹分析

    2.2.1 理化性質(zhì) ZmHKT1;5蛋白由467個氨基酸殘基組成,分子量為50.88 kD,等電點(diǎn)為9.06。含量較高的氨基酸殘基是Leu(58個)、Ser(47個)、Val(44個)、Ala(39個)、Gly(35個),酸性氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為30,堿性氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為38。蛋白分子中含有9個半胱氨酸,假設(shè)全部形成二硫鍵時(shí),280 nm處的摩爾消光系數(shù)為 50 920 L/(mol·cm),0.1% 濃度(1 g/L)的吸光值為1.001。假設(shè)蛋白分子中形成的二硫鍵全部打開,280 nm處的摩爾消光系數(shù)為50 420 L/(mol·cm),0.1%濃度(1g/L)的吸光值為0.991。成熟蛋白質(zhì)在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為40.73,高于閾值40,性質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)為98.31,總平均親水性為0.331,疏水性較強(qiáng)。

    2.2.2 疏水性分析 根據(jù)BioEdit分析結(jié)果可知,整個ZmHKT1;5蛋白中疏水性最大值約為3.09,最小值約為-2.89,疏水性強(qiáng)的區(qū)域按疏水程度從大到小依次為:360~380、250~265、300~325、390~405、45~65、175~200、145~160、125~135、20~35、280~290、440~450、225~235,這些區(qū)域可能是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域(圖2)。

    圖2 ZmHKT1;5蛋白疏水性分析

    2.2.3 信號肽預(yù)測 使用在線信號肽預(yù)測程序SignalP4.0預(yù)測ZmHKT1;5蛋白N端序列,由圖3可知,各值均未超過閾值,ZmHKT1;5不具信號肽。

    圖3 ZmHKT1;5信號肽分析

    2.2.4 跨膜區(qū)域預(yù)測 使用在線工具SOSUI分析ZmHKT1;5的膜結(jié)構(gòu),由表1可知ZmHKT1;5為典型膜蛋白,具有8個跨膜結(jié)構(gòu)。ZmHKT1;5可能的跨膜結(jié)構(gòu)模型如圖4所示。

    圖4 ZmHKT1;5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)模型

    2.2.5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 PredictProtein的預(yù)測結(jié)果表明,ZmHKT1;5含有58.67% α 螺旋(H)、7.07% β折疊(E)和34.26%無規(guī)卷曲(L)。

    2.2.6 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 用Phyre2檢索分析ZmHKT1;5序列,以折疊識別法進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。Phyre2在 PDB(Protein Data Bank)數(shù)據(jù)庫中檢索到編號為c3pjzA的模板(副溶血性弧菌鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體TrkH的晶體結(jié)構(gòu))與目標(biāo)蛋白有很好的同源性,能以100%的信度為目標(biāo)蛋白80%的序列構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)。如圖5所示,ZmHKT1;5蛋白的三級結(jié)構(gòu)根據(jù)氨基酸順序著色,順著蛋白N端到C端著色由淺變深,與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果比照,結(jié)果較為統(tǒng)一,所得三級結(jié)構(gòu)預(yù)測較為可信。

    圖5 ZmHKT1;5蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

    3 討論

    通過生物信息學(xué)手段分析了玉米中新型HKT家族蛋白ZmHKT1;5的蛋白序列,確定了該蛋白分類和進(jìn)化位置。ZmHKT1;5具有在氨基酸序列上絲氨酸特性,可能是1個Na+選擇型的轉(zhuǎn)運(yùn)體。從該各項(xiàng)理化性質(zhì)看,ZmHKT1;5具有較強(qiáng)的疏水性。從二級結(jié)構(gòu)上,ZmHKT1;5含大量α螺旋,也含有較多的無規(guī)卷曲,β折疊的含量較少,這種組成與該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的形成密切相關(guān),為該蛋白的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的實(shí)現(xiàn)提供基本結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。ZmHKT1;5為典型的膜蛋白,具有8個跨膜螺旋,形成4個MPM結(jié)構(gòu),各個跨膜結(jié)構(gòu)的具體生理功能還有待進(jìn)一步探索。已有研究表明,與ZmHKT1;5親緣關(guān)系很近的OsHKT1;5和TaHKT1;5為Na+選擇型轉(zhuǎn)運(yùn)體,能從根木質(zhì)部卸載Na+,通過控制根木質(zhì)部Na+的移動來調(diào)節(jié)水稻中K+/Na+的比率,維持根中高的K+濃度和低的Na+,在植物耐鹽中起了重要作用[16]。另外,根據(jù)ZmHKT1;5的三維構(gòu)象及其與其他HKT類蛋白高度的同源性可以推測,ZmHKT1;5蛋白可能在玉米的Na+吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)控Na+/K+平衡等方面具有重要作用,其生理功能及其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

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