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    加味血府逐瘀湯抗腫瘤作用的實驗研究

    2012-06-07 10:06:03延田偉馬中龍
    世界中醫(yī)藥 2012年1期
    關鍵詞:肝癌小鼠劑量

    李 延田 偉馬中龍

    (1黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,哈爾濱和平路24號,150040;2黑龍江中醫(yī)藥大學;3中國傳統(tǒng)醫(yī)學開發(fā)研究中心)

    加味血府逐瘀湯抗腫瘤作用的實驗研究

    李 延1田 偉2馬中龍3

    (1黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,哈爾濱和平路24號,150040;2黑龍江中醫(yī)藥大學;3中國傳統(tǒng)醫(yī)學開發(fā)研究中心)

    目的:研究加味血府逐瘀湯對小鼠腹水型H22移植性腫瘤模型的抗腫瘤作用和對VEGF的影響。方法:昆明種雄性小鼠100只,接種H22肝癌細胞,建立小鼠腹水型H22移植性腫瘤模型,隨機分為10組,分別給予生理鹽水、卡培他濱、加味血府逐瘀湯(高、中、低劑量)灌胃,連續(xù)10天,第11天處死,觀察抑瘤率、生命延長率的變化;用免疫組化方法檢測VEGF在腫瘤中的表達,SPSS13.0軟件作統(tǒng)計學分析。結果:卡培他濱、加味血府逐瘀湯(高、中、低劑量)組的抑瘤率分別為60%、49%、41%、35%,生命延長率分別為1.68%、157.98%、70.58%、49.57%。結論:加味血府逐瘀湯能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤細胞增殖,明顯延長荷瘤小鼠的生存時間,降低腫瘤組織和瘤周組織中的VEGF表達。

    加味血府逐瘀湯;H22小鼠模型;抑瘤率;生命延長率

    原發(fā)性肝癌(HCC)是我國常見的惡性腫瘤,由于起病隱匿,確診時多已屬中晚期,治療效果差,預后惡劣,嚴重威脅人們的生命與健康。故研發(fā)安全有效的治療HCC的藥物和方法,是國內(nèi)外廣大醫(yī)務工作者的重要課題。我們研究了加味血府逐瘀湯對小鼠腹水型H22移植性腫瘤模型的抗腫瘤作用和對VEGF的影響?,F(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 昆明種清潔級小鼠100只,雄性,體重18~22g,6~8周齡。購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心,置于溫度20℃左右,濕度63%左右,室內(nèi),以普通小鼠飼料喂養(yǎng)。

    1.2 肝癌瘤株 小鼠H22腹水型肝癌瘤株,購自黑龍江腫瘤病防治研究所,清潔級昆明種小鼠傳代。

    1.3 實驗藥物 加味血府逐瘀湯:由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥廠制備,每毫升含生藥1g。然后根據(jù)所需濃度再加以濃縮。卡培他濱(希羅達):購于哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院,上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn),批準文號:國藥準字H20073024。

    1.4 實驗儀器 醫(yī)用凈化工作臺(蘇州凈化設備廠),電子分析天平(沈陽龍騰電子有限公司),超低溫冰箱(日本三洋公司),光學顯微鏡(日本Olympus光學儀器公司),CAPP微量加樣器(丹麥產(chǎn)200μL、10μL)。

    1.5 實驗制劑 無水乙醇、二甲苯、蘇木素液、雙氧水溶液、氫氧化鈉溶液等試劑均購自哈爾濱萬騰醫(yī)療器械化學試劑批發(fā)站。小鼠VEGF抗體,辣根標記抗兔PV-6011(二抗)、辣根標記抗小鼠PV-6002(二抗)購自北京中杉金橋生物技術有限公司生產(chǎn)。

    1.6 實驗方法 建立小鼠H22腫瘤模型,造模24h后,根據(jù)隨機數(shù)字表將50只模型小鼠隨機分成5組,每組10只。灌胃給藥10天,每日1次。模型組(A組):給予0.9%NaCl 0.4mL/20g,陽性對照組(B組):給予希羅達375mg/kg,0.4mL/20g,JW低、中、高劑量組(C、D、E組):分別給予加味血府逐瘀湯12.5g/kg、25g/kg、50g/kg,0.4mL/20g。將其余50只模型小鼠根據(jù)體重分層隨機分為5組,每組10只,組別和給藥劑量同前。每日灌胃給藥,連續(xù)10天后,改為每3天給藥1次。

    1.7 檢測指標 抑瘤率:末次給藥24h后,稱小鼠體重,用脊髓脫臼法處死小鼠,右上肢腋下皮膚常規(guī)消毒,剝離腋窩處瘤體,分析天平稱取瘤重,計算抑瘤率。生命延長率:給藥10天后開始記錄各組動物死亡時間(以天為單位計算)。結果用平均存活天數(shù)和生命延長率表示。VEGF:制作病理切片,用免疫組化方法檢測VEGF。免疫組化實驗結果判定標準:每組隨機選取10個高倍視野(×400),計數(shù)1000個癌細胞,計算出陽性細胞數(shù)百分比。VEGF陽性表達為腫瘤細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。計算結果后用數(shù)碼相機照相。

    1.8 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計使用SPSS13.0軟件分析。

    2 結果

    2.1 抑瘤率 將腫瘤取出后,稱取瘤重,計算平均瘤重及抑瘤率。結果顯示,生理鹽水組腫瘤明顯重于其他4組,抑瘤率以西藥組最高,加味血府逐瘀湯各劑量組也有明顯的抑瘤作用,其結果見表1。

    表1 加味血府逐瘀湯對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用

    2.2 對生命延長率的影響 加味血府逐瘀湯能明顯延長H22肝癌荷瘤小鼠的生存時間,與模型組和陽性對照組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),結果見表2。

    表2 對H22肝癌荷瘤小鼠生命延長率的影響

    2.3 免疫組化實驗結果 A組VEGF表達明顯高于其他4組,組間比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05),加味血府逐瘀湯中、高劑量組與希羅達組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。具體結果見表3。

    3 討論

    原發(fā)性肝癌(HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢,目前仍以手術治療為主,但術后復發(fā)率高,5年生存率較低,且多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)失去了手術治療的機會,其他治療手段也不甚理想。近年來中醫(yī)藥治療腫瘤越來越受到國內(nèi)外同仁的關注和認同,我們將血府逐瘀湯加入山慈菇、人參、蜈蚣,組成加味血府逐瘀湯,對H22肝癌荷瘤小鼠進行了抗腫瘤作用的研究。

    表3 對H22肝癌腹水瘤荷瘤鼠VEGF表達率的影響

    本課題研究結果顯示加味血府逐瘀湯能明顯抑制H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長,低、中、高劑量組的抑瘤率分別為35%、41%、49%,雖然作用弱于卡培他濱組(60%),但本實驗顯示加味血府逐瘀湯的抑瘤作用與劑量呈正相關,如果加大劑量,其作用還會有所增強,我們將進一步研究。

    評價一個抗腫瘤藥物的優(yōu)劣,最主要的是看其療效和對生活質量的影響,療效中應以生存時間為首位。本實驗結果顯示加味血府逐瘀湯低、中、高劑量組對H22肝癌荷瘤小鼠的生命延長率分別為49.57%、70.58%、157.98%,與陽性對照組(卡培他濱組為1.68%)比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),說明加味血府逐瘀湯能明顯延長H22肝癌荷瘤小鼠的生存時間。結果表明加味血府逐瘀湯組對荷瘤小鼠體重無明顯影響,且精神狀態(tài)較模型組和陽性對照組均佳。

    VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)是促進血管新生最重要的生長因子,是現(xiàn)今為止所知的作用最強的促血管生成因子,可促進血管內(nèi)皮增殖、遷移,調節(jié)內(nèi)皮細胞的凋亡通路,阻礙內(nèi)皮細胞凋亡過程,它是一種選擇性促內(nèi)皮細胞有絲分裂原,通過與VEGF受體結合,增加血管通透能力,引起一系列信號傳導,促進內(nèi)皮細胞的增殖,對腫瘤的浸潤轉移具有重要的意義。VEGF可促進血管內(nèi)皮分裂,促進血管新生,增加血管通透性,促進血漿纖維蛋白的外滲,產(chǎn)生纖維網(wǎng)格,有利于毛細血管網(wǎng)及腫瘤間質的形成[1]。肝癌的血管生成對于肝癌的發(fā)生、侵襲、轉移具有重要的作用[2-3]。有研究表明,實體瘤達到2~3mm3時,如果沒有新的血管生成,腫瘤將不再生長且不會發(fā)生轉移,一直處于“冬眠狀態(tài)”[4]。肝癌是典型的多血管腫瘤,因而抗血管治療是一種最有希望的治療方法。因此,通過觀察藥物對瘤體中VEGF的表達的影響可以探討其作用機制。

    實驗結果顯示A組VEGF表達明顯高于其他4組,組間比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05),加味血府逐瘀湯中、高劑量組與希羅達組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究結果表明:加味血府逐瘀湯能明顯抑制H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長,延長其生存期,對血管內(nèi)皮生長因子具有抑制作用,值得進一步研究。

    [1]Inoshima N,Nakanishi Y,Minami T,et al.The influence of dendritic cell infiltration and vascular endothelial growth factor expression on the prognosis of non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res,2002,8(11):3480-3486.

    [2]Folkman J.Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis.Semin Oncol,2002,29(6 Suppl 16):15-18.

    [3]Cha C,Dematteo RP.Molecular mechanisms in hepatocellular carcinoma development.Best Pract Res Clin Gastroenterol,2005,19:25-37.

    [4]N.Ferrara,VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nat.Rev.Cancer,2002,2:795-803.

    (2010-06-06收稿)

    Anti-tumor Effect of Modified Xuefu Zhuyu Decoction

    Li Yan1,Tian Wei2,Ma Zhonglong3
    (1.First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Add.:No.24,Heping Road,Haerbin,Heilongjiang Province,Post code:150040;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine;3.Traditional Chinese Medicine Research and Development Center)

    Objective:To investigate anti-tumor effect of Modified Xuefu Zhuyu Decoction and its impact on VEGF.Methods:Adult male mice(n=100),inoculated with H22hepatoma cells,were randomized to 10 groups and administered saline,capecitabine,Modified Xuefu Zhuyu Decoction(high,medium and low dose).Tumor inhibition rate,life extension rate and the expression of VEGF in tumors were detected on Day11.Results:Tumor inhibition rate of Capecitabine and Modified Xuefu Zhuyu Decoction at high,medium and low dose were 60%,49%,41%,35%,life extension rate:1.68%157.98%,70.58%,49.57%.Conclusion:Modified Xuefu Zhuyu Decoction can inhibit tumor cell proliferation in tumor bearing mice,significantly prolong the survival time of mice,and reduce expression of VEGF in the tumor tissue.

    Modified Xuefu Zhuyu Decoction;H22mice model;Inhibition rate of tumor;Life extension rate

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