姜黃素對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型大鼠CTGF表達(dá)的影響

薛愛芹，王穩(wěn)，李銀生

（菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校,山東 菏澤 274000；菏澤開發(fā)區(qū)中心醫(yī)院；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院）

姜黃素對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型大鼠CTGF表達(dá)的影響

薛愛芹，王穩(wěn)，李銀生

（菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校,山東 菏澤 274000；菏澤開發(fā)區(qū)中心醫(yī)院；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院）

目的觀察博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺間質(zhì)纖維化模型中肺內(nèi)結(jié)締組織生長因子表達(dá)的變化，探討姜黃素對肺纖維化大鼠肺組織內(nèi)結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響及姜黃素對肺間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用及其可能的機(jī)制。方法建立博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺間質(zhì)纖維化模型。將健康雄性昆明大鼠96只，隨機(jī)分為4組，每組24只，分別為空白對照組、模型組、陽性藥物對照組和姜黃素干預(yù)組。模型組、陽性對照組和姜黃素干預(yù)組均一次性滴入博萊霉素（氣管內(nèi)給予5mg/kg）制作肺纖維化動物模型，空白對照組以同樣方法一次性氣管內(nèi)注入等體積的生理鹽水。造模后第1天，姜黃素干預(yù)組給予姜黃素200mg/kg/d，陽性對照組給予醋酸潑尼松0.56mg/kg/d，空白對照組和模型組每天分別灌服等體積的生理鹽水。各組大鼠分三批分別在造模7d、14d、28d時(shí)隨機(jī)處死8只，取肺組織：1）行病理切片進(jìn)行HE染色，觀察肺組織肺泡炎程度和肺纖維化情況。2）進(jìn)行免疫組織化學(xué)技術(shù)，結(jié)合圖像分析來檢測各組肺組織中結(jié)締組織生長因子蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果空白對照組大鼠結(jié)締組織生長因子表達(dá)低微，模型組大鼠結(jié)締組織生長因子的表達(dá)水平較空白對照組的正常肺組織明顯上升（P<0.01），且與肺纖維化的程度顯著相關(guān)。姜黃素干預(yù)組大鼠和陽性對照組大鼠肺組織中的結(jié)締組織生長因子的表達(dá)與模型組大鼠相比明顯降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但仍高于空白對照組。結(jié)論證明了姜黃素對博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺間質(zhì)纖維化具有明顯的防治作用，其機(jī)制可能是通過抑制結(jié)締組織生長因子在肺組織中的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

姜黃素/治療作用；肺纖維化模型；結(jié)締組織生長因子

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）一般是指在感染、毒物、藥物、嚴(yán)重的外傷、自發(fā)免疫反應(yīng)等不同外源或內(nèi)源因素刺激下引起肺部炎癥反應(yīng)，肺泡持續(xù)性損傷,細(xì)胞外基質(zhì)反復(fù)破壞、修復(fù)、重建并過度沉積，導(dǎo)致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失的一類疾病[1]?；颊咧饕憩F(xiàn)為逐漸加重的呼吸困難，伴有刺激性干咳，病情一般持續(xù)發(fā)展，最終因呼吸衰竭而死亡。預(yù)后差，確診后平均生存時(shí)間2～3年，患者確診后5年病死率達(dá)到65%[2]。美國的一項(xiàng)調(diào)查顯示18～34歲人群的特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（idiothomeol pulmonary fibrosis，IPF）患病率約為7/10萬，75歲以上人群的IPF患病率為227.2/10萬，年發(fā)病率約為1.2～76.4/10萬[3]。其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前還是個(gè)世界性難題。通過動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究已表明，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、結(jié)締組織生長因子（CrGF）、血小板源性生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、IL-1、IL-6等分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在肺纖維化的形成過程中有促進(jìn)作用。

姜黃素是從姜科姜黃屬植物的根莖中提取的一種天然有效成分。目前姜黃素用于抗肝纖維化作用的研究已比較多見，用于抗肺纖維化的研究處于起步階段，其作用機(jī)理比較復(fù)雜，有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。本實(shí)驗(yàn)是進(jìn)一步深入研究其發(fā)揮作用的機(jī)制及途徑?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性昆明大鼠96只，體重20g±2g，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：CXK（豫）2005-0001。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 SABC二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗鼠CTGF多克隆抗體等均購自武漢博士德公司。

1.3 動物造模 腹腔注射10%水合氯醛（2.5mL/kg）麻醉大鼠后，將其仰臥固定在操作臺上，用碘伏、酒精消毒頸部皮膚后，用手術(shù)刀依次逐層分離，直至顯露氣管。然后拿注射器朝向心端經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙刺入氣管，緩慢推入事先準(zhǔn)備好的0.3mL博萊霉素生理鹽水溶液（博萊霉素按5落石出mg/kg比例溶于0.2～0.3mL生理鹽水中）或等體積的生理鹽水溶液，繼續(xù)注入0.3mL的空氣，注入后立即將大鼠直立并左右來回旋轉(zhuǎn)，目的是使藥液盡量在雙肺內(nèi)均勻分布。

1.4 分組、給藥和取材 健康SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組：空白對照組（A組）（氣管內(nèi)注入0.3mL生理鹽水）、模型組（B組）、陽性藥物對照組（C組）和姜黃素干預(yù)組（D組），每組24只。SD大鼠造模后第1天，分別給各組大鼠生理鹽水、醋酸潑尼松、姜黃素。醋酸潑尼松片在使用時(shí)需配成混懸液，用蒸餾水溶解即可。姜黃素在使用時(shí)也需配成混懸液，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解即可。其中A組、B組大鼠分別每天給予劑量為0.014L/(kg·d)的生理鹽水，C組大鼠每天給予劑量為0.56mg/(kg·d)的醋酸潑尼松混懸液，D組大鼠給予姜黃素羧甲基纖維素鈉混懸液，每天劑量為200mg/(kg·d)。分3次分別在造模的7d、l4d、28d后給大鼠取材，各組每次隨機(jī)處死8只，共32只。具體步驟為：大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉（2.5mL/kg）后將大鼠固定，腹主動脈放血處死大鼠，快速開胸取肺臟，冷生理鹽水清洗后，置于-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 肺組織病理學(xué)檢查 取肺組織，按常規(guī)病理學(xué)方法進(jìn)行固定，包埋，切片。將病理切片進(jìn)行蘇木素一伊紅（HE）染色。

1.6 免疫組化染色 常規(guī)脫醋，PBS洗滌，過氧化氫3%孵育，PBS洗滌，標(biāo)記二抗，PBS漂洗后DAB顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，烘干，封片。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。半定量圖像分析：將肺組織各時(shí)點(diǎn)切片，隨機(jī)取染色區(qū)域5個(gè)高倍視野（×400），測量并記錄每個(gè)視野陽性染色的平均積分光密度值（integrated optical density，IOD），并根據(jù)得出的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài) 在實(shí)驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)，A組大鼠飲食量、活動性及大小便無明顯變化，皮毛光澤發(fā)亮，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)。B組大鼠均逐漸出現(xiàn)飲食量減少及活動性差，時(shí)有稀便，皮毛凌亂干枯，缺乏光澤，精神不振，反應(yīng)遲鈍、呼吸急促。C組和D組大鼠隨著用藥時(shí)間的延長，進(jìn)食量、攝水量增加，活動逐漸恢復(fù)，大便偶有稀便，皮毛稍凌亂有光澤，精神狀態(tài)亦隨之好轉(zhuǎn)，呼吸逐漸轉(zhuǎn)平穩(wěn)。C組和D組大鼠的一般狀態(tài)不如A組大鼠，但顯著好于B組大鼠。

2.2 HE染色結(jié)果 病理組織學(xué)改變HE染色顯微鏡觀察可見：A組大鼠在7d、14d和28d時(shí)肺組織結(jié)構(gòu)未見異常。B組大鼠7d時(shí)肺組織以肺泡急性炎癥為主，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，肺泡腔內(nèi)可見積液，肺泡間隔水腫增寬；14d和28d時(shí)大量肺泡結(jié)構(gòu)萎陷、破壞，膠原沉積，成纖維細(xì)胞增生，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，間隔纖維化顯著。該模型中大鼠肺組織經(jīng)歷了一系列的病理變化，形成了穩(wěn)定的肺纖維化。在7d、14d和28d時(shí)C組的肺組織纖維化情況有所好轉(zhuǎn)，部分細(xì)支氣管及肺泡內(nèi)可見炎性細(xì)胞，散在的。與B組相比，肺泡間隔窄，纖維病灶可見于周圍支氣管，增厚的胸膜，程度較輕的纖維化。D組在7d、14d和28d時(shí)肺組織纖維化情況明顯好轉(zhuǎn)，肺泡內(nèi)未見明顯的炎性細(xì)胞，肺泡間隔纖維增生灶較少。細(xì)支氣管周圍的纖維化程度明顯低于模型組。

2.3 免疫組化檢測CTGF的表達(dá)變化

表1 不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中CT-G F表達(dá)的免疫組化染色檢測結(jié)果（平均光密度值）（±s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中CT-G F表達(dá)的免疫組化染色檢測結(jié)果（平均光密度值）（±s）

*與空白對照組組相比P<0.01，△與模型組B組相比P<0.01。

組別 n 7d 14d 28d A 組 80.08±0.020.07±0.020.07±0.01B組 80.15±0.02b 0.27±0.03b 0.38±0.03*C組 80.10±0.02△ 0.20±0.02△ 0.25±0.03△D組 80.11±0.02△ 0.21±0.03△ 0.22±0.02△

分析上述結(jié)果我們可以得到：1）B組在灌注BLM后28天CTGF表達(dá)水平達(dá)到高峰。B組7d、14d、28d肺組織CTGF的表達(dá)較A組有顯著性差異（P<0.01）。2）與B組相比較，C組和D組都能夠明顯降低肺組織CTGF表達(dá)，但兩者比較無顯著性差異。

3 討論

肺纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）是多種已明確或未明確的原因?qū)е禄颊咦罱K以呼吸衰竭而死亡的慢性肺部疾病的共同結(jié)局。其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，被稱為“不是癌癥的癌癥”。主要病理特點(diǎn)傳統(tǒng)理論認(rèn)為炎癥過程占很重要的作用，即肺部的炎癥導(dǎo)致肺的損傷和肺的纖維化，然而，經(jīng)過若干年的研究，很少有證據(jù)證實(shí)以上的觀點(diǎn)[4]。因而，近些年來的研究不再僅僅局限于炎癥，研究顯示各種原因引起的肺泡上皮細(xì)胞的損傷源于多種致纖維化細(xì)胞因子，如結(jié)締組織生長因子（CTGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、血小板源性生長因子（PDGF）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等。由此可見，PF的治療目標(biāo)應(yīng)由傳統(tǒng)的單獨(dú)抗炎轉(zhuǎn)變?yōu)榭辜?xì)胞因子的治療等措施。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，姜黃素具有此作用，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。

3.1 大鼠肺纖維化模型的建立 建立良好的大鼠肺纖維化模型是進(jìn)行本研究的基礎(chǔ)。目前用于PF治療藥物研究的肺纖維化模型有很多種，百葉枯誘導(dǎo)的肺纖維化模型；胺碘酮誘導(dǎo)的肺纖維化模型；二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化模型；石棉誘導(dǎo)的肺纖維化模型；放射源誘導(dǎo)的肺纖維化模型等。最常使用的為博萊霉素氣管內(nèi)給藥誘導(dǎo)肺纖維化模型，因?yàn)樵撝苽浞椒ㄋ媚Ｐ偷牟±斫M織學(xué)改變與人類肺纖維化的病理改變最為相似[5]。常用誘導(dǎo)方法有：博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型，給藥途徑有氣管內(nèi)給藥、經(jīng)鼻給藥、靜脈注射、腹腔注射等。博萊霉素系自輪狀鏈絲菌培養(yǎng)液中提取的一種堿性水溶性糖肽類抗腫瘤抗生素，含有13種組分的復(fù)合物，具有廣譜抗癌作用。其不良反應(yīng)之一為肺毒性，對肺組織的持續(xù)損傷可致最后階段的肺間質(zhì)纖維化。其機(jī)制可能是：BLM被認(rèn)為是一種金屬螯合物，能與Fe2+形成BleomycinFe2+復(fù)合物，這一復(fù)合物能為氧分子（O2）提供電子，形成過氧化物和羥基，正是這些高度活性的中間產(chǎn)物最后破壞DNA，引起DNA分子斷裂。在肺組織的正常細(xì)胞內(nèi)代謝BLM的酶活性低，BLM在肺組織的積聚增多，以致肺的損傷。本研究顯示：A組大鼠在7d、14d和28d各時(shí)期肺支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)正常；B組大鼠7d時(shí)炎癥細(xì)胞聚集于肺泡腔和肺泡間隔，肺泡腔縮小，肺泡間隔增厚；14d時(shí)肺泡腔和肺泡間隔的炎性細(xì)胞滲出減輕，肺泡間隔增厚，可見增多的成纖維細(xì)胞；28d肺泡結(jié)構(gòu)破壞，纖維化穩(wěn)定，并且十分典型明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，證明造模成功。

3.2 姜黃素對大鼠肺纖維化中CTGF表達(dá)的影響結(jié)締組織生長因子（CTGF）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的促纖維化細(xì)胞因子，不僅可以直接刺激成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，還可以專一介導(dǎo)TGFβ的促纖維化作用。事實(shí)上TGFβ促進(jìn)臟器纖維化的信號是通過CTGF向下轉(zhuǎn)導(dǎo)的[6]。而CTGF作為TGFβ的下游效應(yīng)介質(zhì)，其生物學(xué)功能有:1)促進(jìn)細(xì)胞增殖，合成膠原。2）調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)。3）介導(dǎo)細(xì)胞黏附。4）刺激細(xì)胞遷移。5）促進(jìn)血管形成等。

本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化方法結(jié)果顯示：CTGF在A組大鼠的肺組織中幾乎不表達(dá)，而在B組大鼠的肺組織中，CTGF蛋白的表達(dá)明顯升高，而且CTGF的表達(dá)隨著大鼠肺纖維化程度的加重逐漸增高，提示CTGF在肺纖維化的形成過程中起重要作用[7]。D組大鼠的肺組織CTGF蛋白的表達(dá)有一定程度的降低，與B組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明姜黃素能夠從蛋白水平調(diào)節(jié)肺組織CTGF蛋白的活性。

本研究初步探討了姜黃素抗肺纖維化的作用以及作用機(jī)制，也為臨床新藥的開發(fā)提供了一種新的思路。另外該藥具有毒性低、價(jià)格低、藥源充足等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。肺纖維化的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究與臨床研究工作還需更加艱辛的努力。

[1]李麗娜，王華，周蕾，等.博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺間質(zhì)纖維化造模方式的選擇[J].中國免疫學(xué)雜志，2010，26（4）：254–257.

[2]Brown KK，Raghu G.Medical treatment for pulmonary fi-br concepts，and prospects[J].Clin ChestMed，2004，25：759-772.

[3]Antoniou KM，Alexandrakis M G.Cytokine network in pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis，2005，22（2）：91-95.

[4]Moises Selman，Talmadge EKing Jr，Annie Pardo.Idiopathic Pulmonary fibrosis：prevailing and evolving hypothesesabout its pathogenesis and implications for therapy[J].Annals of Internal Medcine，2001，134（2）：136.

[5]Q Iw，Chen X，Poronn IK P，et al.Transforming growth factor2beta/connective tissue growth factor axis in the kidney[J].Int JBiochen CellBiol，2008，40（1）：9213.

[6]Leask A，Parapuram SK，Abraham D J，et al.Connective tissue growth factor（CTGF，CCN2）gene regulation：a potent clinical bio2marker of fibrop roliferative disease[J].JCell Commun Signal，2009，3（2）：89-94.

[7]張雷，盧惠萍，賴國祥，等.結(jié)締組織生長因子在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化中的作用探討[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2005，21（3）：290-292.

R332

A

1008-4118（2012）03-0001-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2012.03.

菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)?；鹧芯空n題，項(xiàng)目編號:H11K08。

李銀生：E-mail：yinshengli@xxmu.edu.cn.

2012-03-19