溫度和鹽度對褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群休眠卵體積的影響

王珊，趙文，焉鴻啟、2

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室，遼寧大連116023;2.沈陽市水產(chǎn)科學(xué)研究所，遼寧沈陽110034)

長期以來，褶皺臂尾輪蟲Brachionus plicatilis被認為是廣泛分布于內(nèi)陸和沿海咸水水體的單一物種［1］，包括S－型和L－型兩種類型。隨著科學(xué)家對生物復(fù)合類群研究的深入和分子生物學(xué)手段的介入，他們發(fā)現(xiàn)褶皺臂尾輪蟲應(yīng)該被視為一個包含隱匿同胞物種的輪蟲復(fù)合類群 (B.plicatilis complex)，其中至少包括3個物種［2－4］。這一復(fù)合類群可以根據(jù)其主要的進化關(guān)系及體型分為三大類群——大型 (L)、中型 (SM)和小型 (SS)。2001年，Ciros－Pérez等［5］分別詳細描述了這三大類群中3種輪蟲 B.plicatilis Müller、B.ibericus n.sp.和B.rotundiformis Tschugunoff的基本形態(tài)特征、生態(tài)特點和交配行為，并且使用分子生物學(xué)方法確定了其種類。這一復(fù)合類群會隨著季節(jié)的改變發(fā)生明顯的周期性變形。目前，相關(guān)的研究基本都集中在食物密度對休眠卵大小的影響上［6－10］，而關(guān)于輪蟲休眠卵的體積隨周圍環(huán)境的變化而發(fā)生改變的研究未見報道。為了更好地了解輪蟲同胞物種間的生態(tài)差異和季節(jié)變異的機理，本研究中，作者在新分類標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，研究了不同溫度和鹽度對褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群中3種同胞物種輪蟲Brachionus plicatilis Müller、B.plicatilis Yamamoto 和 B.rotundiformis Tschugunoff休眠卵體積變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群采自大連市自然博物館附近的一個沿海半咸水池塘——明珠花園水池 (體積約8886 m3，鹽度為5)。

1.2 方法

1.2.1 輪蟲的采集和預(yù)培養(yǎng) 試驗前，先將輪蟲在光照培養(yǎng)箱 (Thermo－3744，±0.1℃)內(nèi)馴化培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)溫度為20℃，鹽度為5，光周期為12L∶12D，光照強度為2500 lx。培養(yǎng)用水取自黑石礁海區(qū)，經(jīng)煮沸消毒后，用蒸餾水稀釋到需要的鹽度，用VIR－211型鹽度計在20℃下測定海水鹽度。每天投喂蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa，每周更換一次培養(yǎng)液。從馴化后的輪蟲中挑選單只輪蟲單獨培養(yǎng)，使其經(jīng)孤雌生殖形成種群。

1.2.2 種類鑒定 從培養(yǎng)出的每個輪蟲種群中隨機挑選出3只帶卵的孤雌生殖個體，用體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醛固定后，在Olympus－CX21顯微鏡下進行鏡檢。將具有典型種類特征的3種輪蟲挑選出來，分別培養(yǎng)，種類鑒定參照前人的標(biāo)準(zhǔn)［5，11－13］。各種輪蟲經(jīng)過孤雌生殖培育形成群體后，將單只輪蟲饑餓后進行DNA提取、PCR擴增、COⅠ測序，參照董云偉等［14］的方法，將測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的相關(guān)序列進行比較，分別應(yīng)用DNAstar 5.0和ClustalX 1.81進行比對，并確定其種類。擴增引物參照Folmer等［15］設(shè)計的引物，每個類群的檢測設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3 溫度和鹽度對3種輪蟲休眠卵體積的影響試驗 隨機從 3種輪蟲 B.plicatilis Müller、B.plicatilis Yamamoto和B.rotundiformis Tschugunoff(分別簡稱為Bm、By和Br)中挑選活力強的懷卵非混交雌體放入燒杯中培養(yǎng)，培養(yǎng)液體積為50 mL，每個燒杯中放25只輪蟲。溫度分別設(shè)為15、20、25℃，每個溫度下分別設(shè)置3個鹽度 (5、15、30)。每個試驗設(shè)2個重復(fù)。

試驗在光照培養(yǎng)箱 (Thermo－3744，±0.1℃)中進行，光周期為12L∶12D，光照強度為2500 lx，投喂蛋白核小球藻，餌料密度為2×106個/mL。培養(yǎng)用水取自黑石礁海區(qū)，經(jīng)煮沸消毒后，用蒸餾水稀釋到需要的鹽度。每6 h攪動一次培養(yǎng)液，使餌料懸浮有利于輪蟲攝食，每2 d更換一次培養(yǎng)液。試驗時間為15 d，15 d后收集休眠卵。將收集的休眠卵用體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林固定，并在Olympus－CH21型顯微鏡 (15×40)下測量輪蟲的卵長 (L，μm)和卵寬 (W，μm)，每組測量20個休眠卵。休眠卵體積 (V，μm3)按照以下公式計算［7］:

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和三因素方差分析，用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 種類鑒定

對3種輪蟲形態(tài)學(xué)的測量結(jié)果表明:Bm的平均被甲長和被甲寬分別為270.90、219.80 μm，By的平均被甲長和被甲寬分別為269.20、205.95 μm，相似的同胞物種Bm的體型比By稍大;Br的體型最小，平均被甲長和被甲寬分別為153.08、124.81 μm。對3種輪蟲的被甲長和被甲寬進行方差分析后可知，3種輪蟲之間存在極顯著差異 (n=25，P＜ 0.01)。

將通過形態(tài)學(xué)鑒定為 B.plicatilis Müller、B.plicatilis Yamamoto和B.rotundiformis Tschugunoff的線粒體COⅠ序列在GeneBank中進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn):Bm的COⅠ區(qū)序列與AY785178(Brachionus plicatilis isolate tianjin4)和AP009408(Brachionus plicatilis mitochondrial)DNA的COⅠ區(qū)序列覆蓋率和相似度都為100%，說明該種輪蟲確為B.plicatilis Müller;By的COⅠ區(qū)序列和AP009408(Brachionus plicatilis mitochondrial)的COⅠ區(qū)序列覆蓋率為97%，相似度為98%，說明該種輪蟲為B.plicatilis Müller的同胞物種;Br的COⅠ區(qū)序列和AY785225的COⅠ區(qū)序列覆蓋率和相似度均為100%，說明該種輪蟲確為B.rotundiformis Tschugunoff。

2.2 休眠卵體積

將3種輪蟲的休眠卵體積進行三因素方差分析(tree－way ANOVA)和多重比較，結(jié)果表明，溫度、鹽度、種類及溫度與鹽度的交互作用對輪蟲休眠卵的體積影響均極顯著 (P＜0.001)。

從表1可見:在各種溫度和鹽度條件下，Br休眠卵的體積均顯著小于另外兩種輪蟲同胞物種Bm和By(P＜0.05)，而這兩種體型相近的輪蟲Bm和By休眠卵的體積只在高溫低鹽 (25℃，5)、高溫中鹽 (25℃，15)、中溫中鹽 (20℃，15)和中溫高鹽 (20℃，30)的條件下差異顯著(P＜0.05)。Br休眠卵的平均體積為 3.68×105μm3，而Bm和By休眠卵的平均體積分別為10.88×105μm3和10.69×105μm3。3 種輪蟲中，休眠卵平均體積最小的是Br，為2.99×105μm3，出現(xiàn)在低溫高鹽 (15℃，30)條件下;休眠卵平均體積最大的是By，為13.23×105μm3，出現(xiàn)在低溫低鹽(15℃，5)條件下。

當(dāng)溫度為15～25℃時，Br和Bm的休眠卵體積在各鹽度下均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，而By的休眠卵體積則呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢。當(dāng)鹽度為5～30時，3種輪蟲休眠卵體積在各溫度下呈現(xiàn)的變化規(guī)律不太一致，總體上呈下降的趨勢。

各溫度條件下，Bm和By休眠卵的體積差異顯著 (P＜0.05)。在中溫條件下，Br的休眠卵體積比其它溫度條件變化顯著 (P＜0.05)，而低溫和高溫條件下的Br休眠卵體積之間變化不顯著 (P＞0.05)。

在低鹽條件下，Bm和By的休眠卵體積比其它鹽度條件變化顯著 (P＜0.05);在高鹽條件下，Br的休眠卵體積比其它鹽度條件變化顯著 (P＜0.05)。

表1 不同溫度和鹽度下3種輪蟲休眠卵的體積Tab.1 The resting egg volume of three rotifer species at different temperatures and salinity 105μm3

3 討論

本研究中鑒定出的Bm和By在基因和表型上都具有很大的相似性，在低溫 (15℃)條件下這兩種輪蟲休眠卵的體積差異并不顯著，可能與它們在低溫條件下基礎(chǔ)代謝降低有關(guān)。但在溫度較高的條件下，兩種輪蟲休眠卵的體積卻表現(xiàn)出了不同的變化規(guī)律，說明微小的基因差異就有可能導(dǎo)致其在不同環(huán)境條件下產(chǎn)生不同的變化。溫度、鹽度及其交互作用對這兩種相似的同胞物種休眠卵的體積影響顯著 (P＜0.05)，其中鹽度和溫度與鹽度的交互作用對其影響極顯著 (P＜0.01)，說明對于這兩種L－型輪蟲來說，休眠卵體積對鹽度的改變較溫度更為敏感，這與它們生活的半咸水池塘的鹽度常年保持在5有關(guān)。

自然條件下，同一水域分布的輪蟲休眠卵的體積會有很大差異［16］，且沉積在自然水域底泥中的褶皺臂尾輪蟲休眠卵體積大小會隨著底泥垂直分層的不同而不同［17］。這種現(xiàn)象可能與環(huán)境因子對輪蟲休眠卵體積的影響有關(guān)。為了探究這一現(xiàn)象，人們研究了不同溫度和鹽度條件下輪蟲休眠卵的變化，結(jié)果表明，在極端的溫度和鹽度條件下，褶皺臂尾輪蟲的休眠卵體積會較大［18］;Pavón－Meza等［19］在對輪蟲Brachionus havanaensis的研究中也證明休眠卵體積與輪蟲體型呈線形相關(guān)。本研究中，Bm和By的休眠卵體積在各個溫度和鹽度條件下都明顯大于Br休眠卵的體積，這與此3種輪蟲的個體大小是緊密相關(guān)的:Br本身屬于S－型輪蟲，而Bm和By則屬于L－型輪蟲。本研究中，最大的平均休眠卵體積出現(xiàn)在低溫低鹽 (15℃，5)條件下，而在此條件下Bm和By休眠卵的體積偏大(表1)。由于Br對低溫 (15℃)不適應(yīng)性，這種輪蟲在低溫條件下沒有表現(xiàn)出這一特點，但在相對適應(yīng)的溫度和鹽度條件下——中溫低鹽 (20℃，5)，該輪蟲休眠卵體積最大。這說明盡管在極端溫度和鹽度條件下輪蟲休眠卵的體積會有所變化，但較大的休眠卵只會出現(xiàn)在該種輪蟲較為適應(yīng)的環(huán)境中。

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