復合膳食纖維對急性重癥胰腺炎大鼠腸黏膜上皮緊密連接蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶的影響

楊吉榮 王蕊娜 武 華

1.山西醫(yī)科大學研究生學院，山西太原 030001；2.山東協(xié)和學院，山東濟南 250100；3.山西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科，山西太原 030001

重癥急性胰腺炎（SAP）是臨床上一種常見的急腹癥，病 情險惡，死亡率高，不僅表現為胰腺局部的病理損傷，而且常常涉及明顯的全身炎癥反應及并發(fā)多器官損傷。腸屏障功能受損后引發(fā)的腸道細菌易位是其繼發(fā)感染和膿毒癥的主要原因[1]。研究證實多種細胞因子和炎性介質的釋放是造成腸道屏障損傷、腸道通透性增加和腸源性感染的原因。復合膳食纖維（DFC）是不易被消化的食物營養(yǎng)素，能清腸通便，幫助消化，減輕受損腸黏膜的損害，改善腸黏膜的微生態(tài)，促進腸道功能的恢復，保護腸黏膜屏障。本實驗通過建立大鼠重癥急性胰腺炎模型，探討復合膳食纖維（DFC）對腸屏障功能的影響，為臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 動物與試劑

健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重200～220 g。瑞素（腸內營養(yǎng)乳劑）、膳食纖維（包括可溶性和不可溶性膳食纖維）由華瑞制藥有限公司提供。occludin、ZO-1以及肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的試劑盒由北京博奧森生物技術有限公司提供，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物模型的建立

采用胰膽管逆行注射法復制SAP模型。Wistar大鼠造模前自由飲水，禁食24 h，腹腔內注射3%戊巴比妥鈉溶液（0.1 mL/100 g）麻醉。采用腹部正中切口打開腹腔，近十二指腸乳頭開口處用無創(chuàng)血管夾夾閉胰膽管，距左右肝管匯合處1 cm處用1 mL注射器穿刺胰膽管，并在該部位用無創(chuàng)血管鉗夾閉胰膽管防止逆流，緩慢推注5%的牛黃膽酸鈉（0.1mL/100 g）。遠近端夾閉胰膽管10 min[2]?？p合十二指腸穿刺孔?？梢娨认俳M織充血、水腫，繼而可見包膜下胰腺組織點狀或小片狀出血?？漳c營養(yǎng)管：經胃幽門區(qū)，避開血管豐富區(qū)，先用粗針戳一破口，然后置入一外徑1.5 mm硅膠管至空腸，于胃壁處縫合固定，經皮下隧道將其自頸部引出，固定于頸部皮膚后關腹[3]。術后隨機抽樣解剖證實為急性重癥胰腺炎。

1.3 實驗分組

將SAP大鼠隨機分為三組：SAP+腸內營養(yǎng)乳劑 （瑞素）組（A組），SAP+瑞素加復合膳食纖維（20 g/L）1組（可溶性膳食纖維 SDF∶不可溶性膳食纖維 IDF=2∶1，B 組），SAP+瑞素加膳食纖維（20 g/L）2 組（SDF∶IDF=1∶2，C 組）。 術后 6 h 開始給予腸內營養(yǎng)，通過注射器按125 mL/（kg·d）分四次給予不同的腸內營養(yǎng)制劑。每組20只，飼養(yǎng)期間自由飲用生理鹽水。

1.4 檢測指標

于術后48 h每組20只大鼠開腹，距回盲部5 cm處取小腸組織10 cm，并與取材后采用頸椎脫臼法處死相應大鼠。所取小腸組織用10%甲醛溶液固定并制成石蠟切片。

1.4.1 小腸組織損傷評估 參考Chiu評分法評估小腸腸黏膜損傷程度[4]。行蘇木精-伊紅染色采用雙盲法在光鏡下觀察組織損傷程度。

1.4.2 oc cl udi n、ZO-1與MLCK的表達 采用常規(guī)SP法測定后DAB顯色，實驗步驟按試劑盒說明書進行，陰性對照用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗，同法進行染色。滴入occludin抗體（1∶200），ZO-1 抗體（1∶200），MLCK 抗體（1∶1 000），每一種切片隨機選卻染色清晰者5～8張，于光鏡下（40×）隨機選取3個視野，并在高倍鏡下（200×）觀察陽性顆粒在細胞內的分布。免疫染色的結果判斷：一個半定量模式，由兩個獨立的無臨床知識的觀察者進行染色評分。細胞中出現棕褐色顆粒為陽性。＞75%的細胞染色判為（+++），51%～75%染色為（++），10%～50%染色為（+），＜10%染色為陰性[5]。所有實驗均重復3次，以保證可重復性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗；計數資料采用精確概率法，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腸內營養(yǎng)支持治療后三組大鼠小腸組織損傷評分比較

B組與C組大鼠的腸黏膜損傷相對于A組較輕，C組大鼠的腸黏膜損傷相對于B組較輕，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。腸內營養(yǎng)支持治療后三組大鼠小腸組織損傷評分比較見表1。

表1 腸內營養(yǎng)支持治療后三組大鼠腸黏膜病理Chiu評分（x±s，分）

2.2 三組小腸黏膜occludin、ZO-1、MLCK蛋白的表達

腸內營養(yǎng)支持治療的B組與C組大鼠的腸黏膜緊密連接蛋白occludin、ZO-1和MLCK的分布表達相對于A組增高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且C組occludin及ZO-1的分布和表達高于B組（P＜0.05）。C組MLCK的分布和表達高于B組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2～4。

表2 小腸黏膜occludin蛋白的表達（例）

表3 小腸黏膜ZO-1蛋白的表達（例）

表4 小腸黏膜 MLCK蛋白的表達（例）

3 討論

腸道上皮細胞的緊密連接狀況直接反映其屏障功能。細胞緊密連接蛋白主要存在于上皮細胞、內皮細胞間的連接復合體中，使相鄰細胞膜緊密靠在一起，形成環(huán)繞細胞的物理屏障結構。閉鎖蛋白occludin是封閉相鄰上皮細胞、內皮細胞之間間隙的重要成分，與質膜下蛋白密切相關共同維護緊密連接的屏障功能。ZO-1起著TJ形成的裝配平臺作用，它將閉鎖蛋白和細胞骨架系統(tǒng)連接在一起，構成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)[6]。MLCK屬于Ca2+/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶家族，在Ca2+和鈣調蛋白存在下，MLCK對肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）進行磷酸化作用，并促進肌球蛋白與肌動蛋白絲間相互作用[7]，誘導連接周圍的肌動蛋白和肌球蛋白絲收縮，對緊密連接和細胞表面產生張力，開放緊密連接[8]。通過使用肌動蛋白解聚劑能開放細胞間緊密連接[9]。在MLCK與腸黏膜屏障關系的研究中發(fā)現，由肌球蛋白Ⅱ調控的輕鏈的磷酸化引起的細胞骨架的收縮是腸上皮屏障破壞的必要因素[10]。

膳食纖維（DF）是指來源于植物，不被小腸中消化酶水解的多糖和極少量木質素的總和，主要為纖維素、半纖維素與果膠類物質，包括可溶性膳食纖維（SDF）和不可溶性膳食纖維 （IDF），SDF在上段腸腔不被消化吸收并在結腸被分解為短鏈脂肪酸（SCAF），可防止腹瀉，維持和刺激腸道細胞的形態(tài)和功能。IDF具有促進腸蠕動，減少有毒物質與腸黏膜的接觸時間，減少蛋白發(fā)酵產生毒物。二者共同保護腸黏膜屏障。本實驗表明，含膳食纖維的瑞素腸內營養(yǎng)組較單純瑞素腸內營養(yǎng)組腸黏膜病理改變輕，occludin、ZO-1以及肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的表達較高，更有利于保護腸黏膜。還可以得出，適當的增加復合膳食纖維（DFC）中IDF的比例，更能減輕腸黏膜損傷，有利于緊密連接蛋白和細胞骨架的修復，保護腸黏膜屏障。但是目前尚無統(tǒng)一的標準。

綜上所述，適當增加IDF可促進腸黏膜的修復，對臨床腸內營養(yǎng)制劑的使用有一定的指導作用。

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