上下法與傳統(tǒng)急性毒性法測定薄荷油LD50的試驗研究

張方舟，王 益，顏文君，周海鵬，周闖華，呂 坪

·法醫(yī)學(xué)·

上下法與傳統(tǒng)急性毒性法測定薄荷油LD50的試驗研究

張方舟，王 益，顏文君，周海鵬，周闖華，呂 坪

目的本實驗以薄荷油為目標(biāo)物，評價了上下法與傳統(tǒng)法小鼠急性毒性試驗相比的優(yōu)缺點。方法采用薄荷油對小鼠灌胃，分別進(jìn)行上下法急性毒性試驗與傳統(tǒng)法急性毒性試驗，觀察中毒現(xiàn)象，計算LD50及其95%可信區(qū)間。結(jié)果上下法薄荷油急性毒性LD50為2 000 mg／kg（798.5～2 150 mg／kg），傳統(tǒng)法LD50為1 589.68 mg／kg（1 405.37～1 798.08 mg／kg）。結(jié)論兩種方法所得LD50值接近，毒性分級相同。上下法作為急性毒性替代法對于藥物安全性評價領(lǐng)域有較好的應(yīng)用價值和發(fā)展前景。

上下法；傳統(tǒng)急性毒性法；半數(shù)致死量（LD50）；薄荷油

急性毒性實驗應(yīng)用范圍很廣，例如食品、藥品、化妝品、農(nóng)藥、工業(yè)毒物等毒理學(xué)安全性評價。諸多研究表明，受多種內(nèi)部和外部因素影響，LD50（半數(shù)致死劑量）往往僅是一個統(tǒng)計數(shù)值。因此，隨著全球?qū)游锔＠年P(guān)注，各種節(jié)省動物使用量的急性毒性替代試驗受到越來越多的關(guān)注。上下法（up-anddown procedure，UDP）是經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）于2001年發(fā)布的急性經(jīng)口毒性試驗方法之一，該方法不僅大大減少了動物的使用量，并且可以最大似然法計算LD50值和95%可信區(qū)間［1－2］。該方法于2008年被我國接納為化學(xué)品檢驗國家標(biāo)準(zhǔn)［3］，已有研究表明，UDP法測定農(nóng)藥等化學(xué)品急性經(jīng)口染毒的LD50與Horn’s法比較結(jié)果相近，毒性分級相似［1，4－6］。但對于藥物有效成分的毒性研究，目前傳統(tǒng)急性毒性試驗及LD50值的精確測定仍是我國藥品注冊法規(guī)的組成部分，UDP法在此方面的適用性研究鮮見報道。尤其當(dāng)前，我國對傳統(tǒng)中藥材或天然藥物成分的安全性評價，缺失較為嚴(yán)重，相關(guān)藥物的急性毒性亟待研究。以薄荷油為例，具有多種藥理功能［7－8］，口服可用于消化道疾病，民間也常用于吸入劑治療惡心、嘔吐、緊張性頭疼等［9］。一般認(rèn)為其無毒，但有報道表明，大量口服可導(dǎo)致肝臟毒性［10］，或引發(fā)間質(zhì)性腎炎和急性腎衰相關(guān)的病癥［9］，并可能導(dǎo)致死亡［10］。

因此，本次試驗研究擬以薄荷油作為受試物，通過比較UDP法與經(jīng)典法（改良寇氏法）LD50的測定結(jié)果，進(jìn)一步了解UDP法替代傳統(tǒng)方法對天然有效成分毒性研究的可靠性，為藥物安全性評價領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物薄荷油（北京弘發(fā)中藥材飲片有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號：Q／DCL004－2008），用芝麻香油配制成適當(dāng)乳液備用。

1.2 實驗動物KM小鼠，體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半，由河南科技大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于河南科技大學(xué)實驗動物中心動物房。

1.3 實驗方法實驗動物隨機分組，雌雄各半，整個試驗過程中，動物自由攝水，每次給藥前一晚禁食不禁水。給藥前稱量體質(zhì)量，觀察14 d，記錄所需動物數(shù)量和實驗耗時。

1.3.1 傳統(tǒng)實驗法 預(yù)實驗：按一次給最大劑量法，給藥0.4 m L／10 g體質(zhì)量；取小白鼠20只，雌雄各半，隨機分為5組，分別灌胃給予5 mg／kg、50 mg／kg、500 mg／kg和2 000 mg／kg 4個固定劑量，另一組灌胃給水作為陰性對照組。正式實驗：取50只小白鼠，雌雄各半，隨機分為5組，依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，給予適當(dāng)濃度受試樣品灌胃。

1.3.2 UDP法 限度試驗：限度劑量2 000 mg／kg（特殊情況限度劑量選擇5 000 mg／kg），用5只動物進(jìn)行預(yù)實驗，按照劑量水平的限度實驗標(biāo)準(zhǔn)，估計LD50。正式實驗：固定默認(rèn)Sigma（級數(shù)因子）0.5，相應(yīng)劑量組距3.2，劑量從以下序列中選擇：175 mg／kg、550 mg／kg、2 000mg／kg。第1只動物給藥劑量低于LD50估計值，如果該動物存活，第2只動物給予高一劑量；如果第1只動物死亡或瀕死狀態(tài)，第2只動物給予低一劑量。在此程序中每次給藥1只動物，間隔至少48 h，并認(rèn)真觀察動物。當(dāng)滿足停止實驗標(biāo)準(zhǔn)之一時，以圖1為例：①在上限劑量時，連續(xù)3只動物存活；②任意連續(xù)6只實驗動物中有5只發(fā)生存活／死亡的轉(zhuǎn)換；③在出現(xiàn)第1次存活／死亡轉(zhuǎn)換后，至少又試驗了4只動物，自此時起，對每只實驗動物進(jìn)行似然比計算，一旦似然比超過臨界值，停止試驗。對于LD50和斜率變化很大的化合物，試驗出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)后再進(jìn)行4～6只實驗動物即可滿足停止規(guī)則。在一些情況下，對于劑量—反應(yīng)曲線斜率較小的化學(xué)物質(zhì)，可能需要更多的動物（最高試驗動物總數(shù)為15）。具體終止試驗條件，亦可根據(jù)AOT425StatPgm軟件的提示進(jìn)行，停止給藥后，同時根據(jù)終止時所用動物的狀態(tài)計算LD50估計值和可信區(qū)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理傳統(tǒng)急性毒性實驗法，依據(jù)每組動物死亡數(shù)，采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計方法（Bliss法或改良寇氏法）計算受試物的LD50及其95%可信區(qū)間。UDP法實驗，將每次染毒劑量及動物的結(jié)局輸入AOT425StatPgm程序［2］，計算LD50和95%可信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 給藥后一般狀況UDP法試驗組與傳統(tǒng)法試驗組小鼠，灌胃薄荷油后，大部分動物立即出現(xiàn)四處不停走動、攀爬、呼吸運動急促，打動等興奮癥狀；30 m in后逐漸安靜，并出現(xiàn)步履蹣跚，行動緩慢，左右搖擺，氣息微弱。大多數(shù)小鼠在灌胃后24 h內(nèi)出現(xiàn)異常反應(yīng)；部分有異常反應(yīng)的小鼠可逐漸恢復(fù)正常。對死亡小鼠解剖，肉眼檢查可見小鼠肝臟有不同程度的顏色變深、呈點狀、表面粗糙；胃及腸道呈氣球狀，小鼠腹部明顯膨大。

2.2 UDP法和傳統(tǒng)法薄荷油灌胃動物死亡情況和LD50計算方法UDP法，選擇限度劑量為：2 000 mg／kg；假定LD50：175 mg／kg；級數(shù)因子設(shè)定為（Sigma）：0.5；使用推薦劑量序列（mg／kg）：2 000，550，175，55，17.5，5.5，1.75。而傳統(tǒng)急性毒性試驗，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果以及文獻(xiàn)LD50值，等比級數(shù)0.8，設(shè)定給藥劑量，假定一半動物組少于半數(shù)死亡，另一半動物組多于半數(shù)死亡；但實際根據(jù)動物的死亡情況，并未形成良好的正態(tài)分布，因此選擇改良寇氏法作為統(tǒng)計方法。具體的動物死亡情況、計算方法和LD50計算結(jié)果，如表1所示。

表1 UDP法和傳統(tǒng)法急性毒性試驗的動物結(jié)局和LD50值

將UDP法動物結(jié)局，輸入AOT425 StatPam程序，顯示LD50為2 000 mg／kg（798.5～2 150 mg／kg）；傳統(tǒng)法經(jīng)改良寇氏法計算，LD50為1 589.68 mg／kg （1 405.37～1 798.08 mg／kg）。在動物消耗方面，UDP法共消耗16只，傳統(tǒng)法共消耗70只。在時間消耗方面，UDP法共消耗24 d，傳統(tǒng)法共消耗14 d。實驗結(jié)果表明，兩種方法所計算的LD50值較為接近，毒性分級相同。對一個未知受試物進(jìn)行經(jīng)典的傳統(tǒng)急性毒性試驗，消耗動物量是較大的，一般預(yù)實驗10 ～20只，正式試驗40～60只，本次試驗耗費動物70只；使用UDP法，限量試驗耗費動物4只，主試驗耗費動物12只，減少動物消耗77.14%。亦可見，UDP法耗時長于傳統(tǒng)法近1倍，這也表明，在使用UDP法時，對動物質(zhì)量的保障供應(yīng)有一定要求。

3 討論

任何一種藥物或制劑在臨床試用前必須進(jìn)行動物毒性實驗，急性毒性實驗是新藥安全性評價的第一道環(huán)節(jié)。但越來越多的新藥研發(fā)機構(gòu)和管理當(dāng)局意識到傳統(tǒng)的急性毒性實驗存在局限性：由于動物生理狀態(tài)、周圍環(huán)境等因素的影響，同一種藥物的LD50在不同的實驗結(jié)果中，往往很難得到一個穩(wěn)定的數(shù)值［11］。以薄荷油的急性毒性LD50值為例，陳光亮等研究表明，薄荷油灌胃給藥最大耐受量＞4 000 mg／kg，腹腔注射LD50為（1 149.9±78.5）mg／kg［12］。而劉紅杰等則報道，口服小鼠薄荷油的LD50為3.0 m L／kg［13］，以薄荷油相對密度（0.888～0.908）換算，相當(dāng)于2 694 mg／kg。與本次試驗結(jié)果皆有較大差別。由此亦可見，LD50值的計算受到各種因素影響較多。而人和動物對藥物的敏感性差別很大，很難期望使用動物的急性毒性試驗的結(jié)果來推測對人體的毒性情況［14］。由于LD50測定造成的不必要的動物和資源的浪費，受到倫理學(xué)界和科學(xué)界越來越廣泛的批評，而采用消耗動物較少的急性毒性替代試驗將是藥物急性毒性試驗的必然趨勢。

本次試驗結(jié)果也表明，采用UDP法所獲得的LD50值與傳統(tǒng)法較為接近，使用的動物數(shù)遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)法所消耗的動物數(shù)。給藥后觀察到，口服薄荷油的中毒小鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒性作用，這與傳統(tǒng)法以及已有報道較為一致［12］。由此可見，UDP法是傳統(tǒng)急性毒性試驗的一種優(yōu)良替代方法，能夠以最少的實驗動物和受試樣品量，與傳統(tǒng)方法一樣得到受試物的LD50值及相應(yīng)的可信區(qū)間；對每只給藥后的動物進(jìn)行48 h的密切觀察，并對未死亡的動物持續(xù)觀察14 d，能夠提供全面的受試動物毒性表現(xiàn)的資料［15］。這符合藥物安全性評價動物急性毒性的實驗要求。因此，UDP法作為急性毒性替代實驗法在新藥研發(fā)和藥品申報領(lǐng)域具有一定的發(fā)展空間［14，16］。該方法的不足之處在于：由于試驗要求分階段進(jìn)行，因此耗時較長，同時又要有相同動物質(zhì)量供應(yīng)的保障，無法提供量效關(guān)系數(shù)據(jù)，只適于評價染毒后48 h內(nèi)出現(xiàn)毒性癥狀并死亡的受試品的急性毒性［6，15］

［1］ Rispin A，F(xiàn)arrar D，Margosches E，et al.Alternativemethods for themedian lethal dose（LD50）test：the Up-and-Down procedure for acute oral toxicity［J］.ILAR Journal，2002，43 （4）：233－243.

［2］OECD.OECD guidelines for the testing of chem icals guideline 425 acute oral toxicity-Up-and-Down procedure［S］.Paris：OECD，2001：1－26.

［3］ 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB／T 21826 －2008化學(xué)品急性經(jīng)口毒性試驗方法上下增減計量法（UDP）［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：1－24.

［4］ 連勇，徐培渝，孫強.上—下法替代實驗與Horn’s法測定LD50的試驗研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35（18）：3591 －3593.

［5］ 譚劍斌，趙敏，楊杏芬，等.3種替代方法在急性經(jīng)口毒性實驗中應(yīng)用研究［J］.中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2011，38（增刊）：1 －4.

［6］ 張林媛，孫金秀.上下增減劑量法與Horn’s法測定LD50的研究［J］.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2003，17（4）：234－236.

［7］ 陳光亮，余玉寶，李冬梅.薄荷油及其有效成分藥理作用的研究概況［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2000，7（2）：33 －34.

［8］ 花盈，狄留慶.薄荷油的基礎(chǔ)研究及其應(yīng)用開發(fā)［J］.世界臨床藥物，2006，27（8）：505－507，512.

［9］ 漣漪.薄荷油（Pepperm int oil）［J］.國外醫(yī)藥：植物藥分冊，2005，20（1）：42－43.

［10］劉紅杰，金若敏.薄荷油研究進(jìn)展［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，30（6）：502－505.

［11］朱心強，黃幸紓，葉方友，等.固定劑量法與傳統(tǒng)LD50試驗的比較［J］.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，1992，6（4）：287，281.

［12］陳光亮，姚道云，汪遠(yuǎn)金，等.薄荷油藥理作用和急性毒性的研究［J］.中藥藥理與臨床，2001，17（1）：10－12.

［13］劉紅杰，金若敏，張文斌，等.薄荷油致小鼠肝毒性時－量關(guān)系及其機理研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（12）：2954－2956.

［14］郭家彬，彭雙清.動物實驗替代方法與21世紀(jì)毒性測試發(fā)展策略［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21（10、11）：157－161，156.

［15］李佳，金晶，黃芝瑛.上下法在急性毒性試驗中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（6）：70－72.

［16］胡啟之.OECD新發(fā)布急性經(jīng)口毒性試驗方法簡介［J］.毒理學(xué)雜志，2005，19（4）：323－325.

Experim ental Study on Measurement of Pepperm int Oil LD50 With Up-and-Down Procedure and Traditional Acute Toxicity Testing

ZHANG Fang-zhou，WANG Yi，YAN Wen-jun，et al
（College of Forensic Medicine，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

ObjectiveThe peppermint oilwas used as a target object in this experiment.To evaluate the advantage and disadvantage of the up-and-down procedure and the traditional acute toxicity testing.Methods Mice were orally administered with peppermint oil to respectively conduct the up-and-down procedure acute toxicity test and traditional method acute toxicity test，observing the poisoning phenomenon and calculating the median lethal dose（LD50）and 95%confidence intervals.ResultsThe LD50values of peppermint oil from the two methods were 2 000 mg／kg（798.5～2 150 mg／kg）with the up-and-down procedure and 1 589.68 mg／kg（1 405.37～1 798.08 mg／kg）with the traditionalmethod respectively.ConclusionThe LD50values that get from the two methods are similar，and the toxicity grading is equal.This shows that the up-and-down procedure，as an alternativemethod of acute toxicity，has better application value and development prospects in the field of drug safety evaluation.

up-and-down procedure；the traditional acute toxicity testing；median lethal dose（LD50）；pepperm int oil

R965.3

A

1672－688X（2012）04－0268－03

2011年河南科技大學(xué)SRTP項目（2011179）

2012－10－07

河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽471003

張方舟（1989－），男，河南三門峽人，法醫(yī)2009級在校本科生。

呂坪，女，博士，講師，E-mail：lping2008＠163.com