木糖醇對(duì)豬精液低溫保存的影響

楊 楊

（江蘇省句容市畜牧獸醫(yī)站，句容 212400）

雖然豬精液保存技術(shù)的研究已有近50年的歷史[1]，但其保存效果很不理想。主要原因是低溫保存和冷凍保存后精子活率、頂體完整率、受精能力等都比鮮精要差[2]。在精液低溫保存的過程中，精子膜的完整性對(duì)復(fù)蘇后精子的活力和受精能力是至關(guān)重要的。目前，國內(nèi)外已有報(bào)道，在牛、羊的凍精稀釋液中添加糖類、氨基酸和牛血清白蛋白能保護(hù)精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性[3-6]。

甘油和糖類是常用的冷凍保護(hù)劑，一般甘油限制在1%～3%為宜[7]。在豬精液，冷凍稀釋液中多加有甘油等抗凍物質(zhì)，以增強(qiáng)精子抗凍能力，對(duì)防止冰晶發(fā)生有重要作用。但甘油濃度過高對(duì)精子有毒害作用，造成精子頂體和頸部損傷，尾部彎曲等。對(duì)豬精子來說，當(dāng)甘油濃度增大時(shí)，冷凍精液，活率雖高，但受胎率極不理想。由于多數(shù)糖類能被細(xì)胞分解代謝。因此，常使用糖類代替部分甘油，以減少對(duì)精子的毒害作用，這方面已有不少報(bào)道[1，12，15]，但僅利用雙糖（乳糖和蔗糖）代替甘油的研究還未見報(bào)道。

雙糖包括多種，如乳糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、纖維二糖等。本實(shí)驗(yàn)主要研究木糖醇的添加量。即豬精液冷凍稀釋液中單獨(dú)添加不同濃度的乳糖或蔗糖，以及添加不同比例的乳糖和蔗糖代替部分甘油對(duì)顆粒凍精凍后活率，活力，頂體完整率和精子畸形率的影響。

手握法采集成年長白種公豬精液，離心去精清，收集富含精子的部分，在精液稀釋液中加入不同濃度的木糖醇和甘油，采用液氮熏蒸法制作顆粒凍精。在40℃～45℃下解凍觀察。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)健康、性欲旺盛的成年長白種公豬1頭，18月齡。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、電動(dòng)離心機(jī)、生物顯微鏡、恒溫載物臺(tái)、電子天平、冰箱、聚四氟乙烯板、超低溫溫度計(jì)、雙重水自動(dòng)蒸發(fā)儀。

1.3 稀釋液的配制

電子天平準(zhǔn)確稱量各種試劑后，用雙蒸水定容、過濾、滅菌，配制成Ⅰ液。采精前，按比例配成Ⅱ液，置于35°C水浴中預(yù)熱。其各種物質(zhì)含量如下所示：

Ⅰ液：葡萄糖8 g；蒸餾水 100 ml。

Ⅱ液：?、褚?7 ml，加入卵黃20 ml，青霉素和鏈霉素各5～10萬U。

最后向Ⅱ液加入不同濃度的蔗糖、乳糖即為所用的冷凍稀釋液。其添加量詳見表1、表2。

表1 在稀釋液中單獨(dú)乳糖和蔗糖的含量（g/100 ml）

表2 在稀釋液中按不同比例添加乳糖與蔗糖（g/100 ml）

1.4 精液采集

采精前將集精杯預(yù)熱至35 ℃～37℃，以發(fā)情母豬誘導(dǎo)成年公豬爬跨。待公豬陰莖伸出后，用手握法采精。采精后選擇中段濃份精液用4層紗布過濾，除去膠狀物后，在37℃下進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)檢查。選擇無異味、色澤為乳白色、精子形態(tài)正常、活率在0.7以上的精液用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 精液的預(yù)處理

將合格精液在保溫壺中（32℃～35℃）中靜置60～80min，使精子和精清充分接觸，然后經(jīng)800 r/min離心10 min，棄去上部精清的4/5。為防止長時(shí)間靜置使豬精子進(jìn)入假死狀態(tài)，離心前應(yīng)輕輕晃動(dòng)集精瓶數(shù)次，以使精子恢復(fù)活力。

1.6 精液的稀釋與平衡

采用二次稀釋法，先將Ⅰ液按1∶1的比例緩慢倒入精液中進(jìn)行等溫稀釋（32℃～35 ℃）后，再用12～15層紗布包裹集精瓶，連同Ⅱ液一起放入2℃～5 ℃冰箱中平衡2 h，然后加入與第一次稀釋后精液總量相等的Ⅱ液，使精液最終稀釋比例為1：3，繼續(xù)平衡1～2 h備用。

1.7 低溫精液的制作

低溫保存的溫度是0℃～5℃。一般將稀釋好的精液置于冰箱或廣口保溫瓶中，在保存期間要保持溫度恒定，不可過高過低。操作時(shí)注意嚴(yán)格遵守逐步降溫的操作規(guī)程，原則上精液稀釋后，要逐漸降溫到0℃～5℃，避免精子發(fā)生冷休克。所以一般要用平均每30 min降低5℃的速度降溫，即下降速度約為0.2℃/min。在生產(chǎn)實(shí)踐中，為了提高工作效率，都采用直接降溫法。即將分裝有稀釋精液的試管（或小瓶），包以數(shù)層紗布或棉花，再裝入塑料袋中，而后直接放入冰箱（0℃～5℃）或裝有冰塊的廣口保溫瓶中，也可將其放入30℃溫水（室溫）杯中，再一起直接放入0℃～5℃的環(huán)境中，經(jīng)1～2 h。精液溫度降至0℃～5℃。

1.8 解凍與鏡檢

顆粒凍精采用干解凍法，將顆粒凍精放入滅菌試管內(nèi)，用40℃～45℃溫水解凍（時(shí)間為8～10s），在37℃恒溫載物臺(tái)上，400～600倍生物顯微鏡下評(píng)定活率，頂體完整率，精子畸形率等指標(biāo)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理各組數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加木糖醇和甘油對(duì)豬精液在室溫下活率的影響

選取不同比例的乳糖或蔗糖，加入稀釋液中制成顆粒凍精，結(jié)果如圖1所示。

圖1 稀釋液中單獨(dú)添加乳糖或蔗糖時(shí)的活率

由圖1可知，1號(hào)、5號(hào)的活率最好，顯著高于其他組（P<0.05）。即在稀釋液中添加1%的乳糖效果最好（P<0.05），在添加蔗糖時(shí)以2%的比例最佳（P<0.05），而添加1%的乳糖又較添加2%的蔗糖好（P<0.05）。從總體來看，添加乳糖比添加蔗糖的效果好。

2.2 單獨(dú)添加木糖醇對(duì)豬精液室溫下活率的影響

在稀釋液中按比例單獨(dú)添加乳糖或蔗糖，以替代不同濃度的甘油。結(jié)果詳見表3。

從表3可以看出，精子畸形率檢測中1號(hào)、2號(hào)明顯優(yōu)于其他（P＜0.05）。4號(hào)及6號(hào)頂體完整率與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）。

2.3 添加木糖醇和甘油對(duì)豬精液5度下活率的影響

選取5種不同比例的乳糖與蔗糖的稀釋液（乳糖：蔗糖），替代部分甘油，制成顆粒凍精解凍后的精子活率結(jié)果如圖2所示。

圖2 同時(shí)添加乳糖和蔗糖時(shí)精子的活率

由圖2可知，B組、C組的活率較好，分別達(dá)到0.39，0.35且與其他組差異顯著（P<0.05）。

2.4 不添加甘油對(duì)豬精液5度下活率的影響

選取5種不同比例的乳糖與蔗糖的稀釋液（乳糖：蔗糖），替代部分甘油，結(jié)果詳見表4。

從表4可以看出，精子畸形率A、B組差異顯著（P<0.05）。而B、C組的頂體完整率較好，且差異顯著（P<0.05）。

3 討論

3.1 單獨(dú)添加乳糖或蔗糖對(duì)豬精液凍后活率的影響

關(guān)于豬凍精稀釋液成分多種多樣，但使用最多的還是糖類。目前，國內(nèi)外已有報(bào)道，糖類、氨基酸和牛血清白蛋白通過對(duì)質(zhì)膜的穩(wěn)定，發(fā)揮其對(duì)精子的保護(hù)作用[3-6]。牧人等[1]研究了蔗糖等對(duì)白絨山羊冷凍精液的影響，褚仁忠等[8]也研究了糖類保護(hù)劑對(duì)山羊凍精的影響，結(jié)果都表明在羊上糖類對(duì)冷凍精液有較好的保護(hù)作用。在豬上也有較多的關(guān)于糖類稀釋液的研究，李青旺等[9]對(duì)添加不同量的葡萄糖，蔗糖，乳糖的稀釋液作了詳盡的研究，結(jié)果表明低濃度的乳糖與葡萄糖混合使用可取得較好的效果，豬精液凍后活率可達(dá)0.53。而且李震鐘等[10]研究也表明，在豬凍精稀釋液中添加2%～4%的葡萄糖效果較好，濃度過高對(duì)精子頂體就會(huì)有損害。本實(shí)驗(yàn)表明，稀釋液中添加1%乳糖時(shí)，精子活率較高（P<0.05），說明乳糖可以代替部分的甘油，以1%為宜。稀釋液中添加2%蔗糖時(shí)，精子活率比對(duì)照組的活率高（P<0.05），說明蔗糖也可代替部分的甘油，以2%為宜。從添加乳糖和添加蔗糖對(duì)照來看，添加乳糖的顆粒凍精活率較添加蔗糖的活率高。說明乳糖比蔗糖更適宜代替部分甘油。這與Paulenz等[11]研究結(jié)論相似。

3.2 單獨(dú)添加乳糖或蔗糖對(duì)豬精液凍后精子畸形率，頂體完整率的影響

本實(shí)驗(yàn)表明，2號(hào)、3號(hào)顆粒凍精的精子畸形率明顯較低。說明一定量的乳糖（1%～2%）對(duì)精子具有保護(hù)作用。減少了由甘油引起的精子頂體和頸部的損傷及尾部彎曲等。而5、7號(hào)頂體完整率較好，說明添加一定量的蔗糖可以減少精子頂體的損傷，對(duì)精子具有一定的保護(hù)作用。

3.3 同時(shí)添加乳糖和蔗糖對(duì)豬精液凍后活率的影響

本實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)稀釋液中乳糖與蔗糖比例為2∶1時(shí)，顆粒凍精的活率最好，為0.39，差異顯著（P<0.05）。當(dāng)乳糖與蔗糖比例為1∶2時(shí)，顆粒凍精的活率為0.35，差異顯著（P<0.05）。當(dāng)這2者進(jìn)行比較，比例為2∶1時(shí)的活率明顯優(yōu)于1∶2（P<0.05）。從總體來看，混合添加乳糖與蔗糖的效果優(yōu)于單獨(dú)添加的效果。

表3 稀釋液中單獨(dú)添加乳糖或蔗糖的結(jié)果（%）

表4 同時(shí)添加乳糖和蔗糖對(duì)豬精液凍后精子畸形率及頂體完整率的影響（%）

3.4 同時(shí)添加乳糖和蔗糖對(duì)豬精液凍后精子畸形率及頂體完整率的影響

實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)稀釋液中乳糖與蔗糖比例為2∶1或1∶2時(shí)，頂體完整率明顯上升，并且差異顯著（P<0.05），說明當(dāng)稀釋液中乳糖與蔗糖比例為2∶1或1∶2時(shí)對(duì)精子頂體有一定的保護(hù)作用?？梢钥闯觯?種雙糖對(duì)精子都有一定的保護(hù)作用，但乳糖較蔗糖要好一些，所以當(dāng)乳糖比例較高時(shí)，精子活率，頂體完整率都較好一些。

目前，各種家畜冷凍精液的稀釋液一般都含有糖類和甘油，但并沒有一個(gè)明確的最佳添加量。尤其是甘油，已證實(shí)，冷凍稀釋液中添加棉籽糖、蔗糖、等類物質(zhì)，以及甘油、乙二醇、緩沖劑、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）及可可堿和萘類物質(zhì)對(duì)公豬精液的冷凍保存均有幫助但在所篩選的各種動(dòng)物精子冷凍保護(hù)液毫無例外的都保留有甘油，研究表明，甘油的冷凍保護(hù)效果在高濃度時(shí)效果最明顯，然而當(dāng)甘油濃度高于0.5 ml/L（≈9.2%）時(shí)對(duì)精子是有害的[12-14]。本實(shí)驗(yàn)研究中甘油添加量并沒有一個(gè)確定的量，在添加乳糖時(shí)，甘油的添加量為2%時(shí)效果最好，這與周佳勃等[15]，李青旺等[9]的研究結(jié)果相似。但在添加蔗糖中甘油的添加量為1%時(shí)效果較其他的要好，綜合來看這應(yīng)與糖的種類和添加量有關(guān)。這還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

4.1 稀釋液中添加1%和2%乳糖時(shí)，精子畸形率較低，分別為7.1%和8.6%（P<0.05）。添加1%及3%蔗糖時(shí)頂體完整率較好，分別為86.7%和86.8%（P<0.05）。

4.2 稀釋液中添加1%乳糖時(shí)，活率為0.38差異顯著（P<0.05）。稀釋液中添加2%蔗糖時(shí)，活率為0.36差異顯著（P<0.05）。

4.3 當(dāng)稀釋液中乳糖與蔗糖比例為2∶1或1∶2時(shí)，頂體完整率為88.2%及88%差異顯著（P<0.05）。

4.4 稀釋液中乳糖與蔗糖以2：1及1：2的比例添加時(shí)，活率最好，分別為0.39和0.36差異顯著（P<0.05）。

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