混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽工藝條件優(yōu)化

鞠興榮，王雪峰，何 榮，王立峰，袁 建

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽工藝條件優(yōu)化

鞠興榮1,2，王雪峰1，何 榮1,2，王立峰2，袁 建1

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210003；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

以肽得率、氮溶解指數(shù)和硫苷降解率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)初步得到枯草芽孢桿菌與雅致放射毛霉混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的發(fā)酵條件，再根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化混菌發(fā)酵條件，確定最佳工藝條件為：枯草芽孢桿菌與雅致放射毛霉同時(shí)接種，兩菌接種體積比4:1、發(fā)酵溫度32.1℃、發(fā)酵時(shí)間4.64d，此條件下菜籽肽得率為9.85%，硫苷降解率為67.83%。

混菌固態(tài)發(fā)酵；菜籽肽；工藝條件；響應(yīng)面分析法

菜籽蛋白是一種豐富、優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，但是卻沒有像大豆蛋白那樣得到廣泛的應(yīng)用，主要原因有兩個(gè)：一是菜籽蛋白中含有少量硫苷、植酸、單寧等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，降低了菜籽蛋白的生物利用率。其中，硫苷作為主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，在酸、堿溶液中或者酶溶液中會(huì)發(fā)生分解，其分解產(chǎn)物能造成動(dòng)物甲狀腺、肝臟、腎臟等器官的損害[1-3]，對(duì)動(dòng)物的繁殖機(jī)能也會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響；二是菜籽蛋白的研究力度還遠(yuǎn)比不上大豆蛋白。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者逐漸對(duì)菜籽蛋白進(jìn)行了相關(guān)研究，如菜籽粕的脫毒[4]、菜籽蛋白的分離純化[5-6]、菜籽多肽的制備及其生物活性研究[7-8]等，這些技術(shù)的應(yīng)用主要是為了解決菜籽蛋白本身營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而利用率低的問(wèn)題，為進(jìn)一步開發(fā)、利用菜籽蛋白奠定了基礎(chǔ)。

近年來(lái)，發(fā)酵技術(shù)在大豆肽的生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用，其中，混菌發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用也逐漸得到了推廣[9-10]?；炀l(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的研究在我國(guó)鮮見報(bào)道，但混菌發(fā)酵脫毒菜籽粕的研究較多，且大量研究表明其脫毒效果明顯[11-12]。因此，如果將混菌發(fā)酵技術(shù)有效應(yīng)用在菜籽肽的生產(chǎn)和菜籽粕的脫毒上，將為菜籽蛋白的高效利用提供一條新的途徑。本實(shí)驗(yàn)在枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽培養(yǎng)基條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討接種順序、接種比例、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時(shí)間對(duì)混菌發(fā)酵效果的影響，應(yīng)用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)混菌固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的最佳發(fā)酵工藝條件，以期為菜籽肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽粕(粗蛋白質(zhì)含量38.47%、水分含量11.46%、硫苷含量52.38μmol/g) 南京隆盛植物油脂有限公司；Gly-Gly-Tyr-Arg 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

1.2.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)10160、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) 40252 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2.2 培養(yǎng)基

1.2.2.1 種子培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸餾水1000mL、瓊脂20g，pH7.2，121℃滅菌20min，不加瓊脂作液體培養(yǎng)基使用；雅致放射毛霉采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL。

1.2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基成分按混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽培養(yǎng)基條件優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行配比：菜籽粕9.5g、麩皮0.5g、加水1 3.5 g、葡萄糖添加量為固液總質(zhì)量的0.5 0%、KH2PO4添加量為固液總質(zhì)量的0.36%。

1.3 儀器與設(shè)備

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；722N紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠；GL-20B型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；全溫立式振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；PQX 型多段可編程培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司；ALpHA2-4型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液制備

枯草芽孢桿菌經(jīng)斜面活化后刮取兩環(huán)接入100mL液體種子培養(yǎng)基，8層紗布封口后，在37℃、120r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24h。雅致放射毛霉接種于斜面培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)5d。從枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基和雅致放射毛霉斜面培養(yǎng)基中分別取一定量的細(xì)菌和孢子于無(wú)菌水中，調(diào)節(jié)菌體濃度為1×107CFU/mL。無(wú)菌水中事先加入葡萄糖和KH2PO4(分別以發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，按添加量添加)，調(diào)節(jié)pH值至6.5，即可得到發(fā)酵劑。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

混菌組合中的菌種不分先后，同時(shí)把制備好的菌懸液以1×107CFU/mL的接種量接入已滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在一定的溫度和濕度條件下恒溫培養(yǎng)，定時(shí)攪拌通氣，培養(yǎng)一定時(shí)間后取樣測(cè)定。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的處理

發(fā)酵后的固態(tài)基質(zhì)，一部分取樣后加蒸餾水定容至150mL，攪拌30min，2～4℃條件下4000×g離心20min，測(cè)定其上清液體積，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾上清液，除去不溶物和細(xì)菌，備用。另一部分取樣后冷凍干燥、粉碎，用于樣品中硫苷含量的測(cè)定。

1.4.4 肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用5g/100mL三氯乙酸(TCA)配制不同質(zhì)量濃度的Gly-Gly-Tyr-Arg標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照多肽含量測(cè)定方法對(duì)樣品顯色，于波長(zhǎng)540nm處測(cè)定其OD值。以多肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(χ，mg/mL)，OD540nm值為縱坐標(biāo)(y)，制作Gly-Gly-Tyr-Arg標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y＝0.0259χ＋0.0034，R2＝0.9993。

1.4.5 指標(biāo)測(cè)定

1.4.5.1 細(xì)菌數(shù)量測(cè)定

采用血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定[13]。

1.4.5.2 氮溶解指數(shù)測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]所述方法進(jìn)行測(cè)定。氮溶解指數(shù)按公式(1)計(jì)算。

1.4.5.3 多肽含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]所述方法，取5mL處理液，加入等體積10% TCA，靜置30min，2～4℃、4000×g離心20min，取2mL上清液，加8mL雙縮脲試劑，25℃靜置30min，測(cè)OD540nm值。肽得率按公式(2)計(jì)算。

1.4.5.4 硫苷含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]所述方法進(jìn)行測(cè)定。硫苷降解率按公式(3)計(jì)算。

1.4.6 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽培養(yǎng)基條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，首先確定混菌發(fā)酵的接種順序，再分別對(duì)接種比例、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定其最佳因素水平。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化分析，得出菜籽肽混菌發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌發(fā)酵接種順序的確定

枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉按體積比1:1的接種比例，采用同時(shí)接種、先接入枯草芽孢桿菌12h和24h后接入雅致放射毛霉、先接入雅致放射毛霉12h和24h后接入枯草芽孢桿菌的方法進(jìn)行接種，30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)3d，考察不同接種順序?qū)Πl(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同接種時(shí)間對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of different inoculation patterns on fermentation indexes

由圖1可知，同時(shí)接種比分時(shí)間段接種的發(fā)酵效果要好，其中，除硫苷降解率變化不明顯外，肽得率和氮溶解指數(shù)的變化比較明顯，兩個(gè)指標(biāo)均處于最大值，這可能是由于先接入的菌種在發(fā)酵過(guò)程中占有優(yōu)勢(shì)地位，當(dāng)再接入其他菌種時(shí)會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，影響了自身生長(zhǎng)產(chǎn)酶[9]，因此確定接種順序?yàn)橥瑫r(shí)接種。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 混菌不同接種比例對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響

圖2 混菌不同接種體積比對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of inoculation ratio of Bacillus subtilis to Actinomucor elegans on fermentation indexes

將枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉按不同接種體積比(分別為1:2、1:1、2:1、3:1、4:1)同時(shí)接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)3d，考察混菌不同接種體積比對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖2。3個(gè)指標(biāo)都呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中，肽得率和氮溶解指數(shù)變化相對(duì)比較同步，都隨著枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉接種體積比的增加而增大，且在接種體積比為3:1時(shí)達(dá)到最大值，這表明：隨著接種比例的增加，兩種菌的生長(zhǎng)具有互利性，能夠產(chǎn)生更多的蛋白酶水解菜籽蛋白并生成菜籽多肽。然而，硫苷降解率在接種體積比為2:1時(shí)達(dá)到峰值，之后隨著接種比例的增加而降低，說(shuō)明接種比例的增加并不一直有利于這兩種菌產(chǎn)生更多的芥子酶系，但相對(duì)肽得率和氮溶解指數(shù)，硫苷降解率在接種體積比為1:1～3:1之間變化并不明顯。綜合考慮枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌發(fā)酵較佳的接種體積比為3:1。

2.2.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響

枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉按接種體積比3:1，同時(shí)接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在20、25、30、35、40℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)3d，考察不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on fermentation indexes

溫度的變化對(duì)枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉兩種菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶及酶的活性有著直接的影響。由圖3可知，溫度過(guò)低或過(guò)高均不利于這兩種菌的混合發(fā)酵，溫度過(guò)低，菌體生長(zhǎng)不佳，產(chǎn)酶量較少；溫度過(guò)高，會(huì)抑制其生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致其死亡。隨著發(fā)酵溫度的增高，3個(gè)指標(biāo)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在30～33℃之間發(fā)酵效果較好，并在30℃各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)都達(dá)到最大值。因此，選取30℃作為混菌發(fā)酵的最佳溫度。

2.2.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響

枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉按接種體積比3:1，同時(shí)接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃條件下分別發(fā)酵培養(yǎng)2、3、4、5、6d，考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of fermentation duration on fermentation indexes

發(fā)酵時(shí)間會(huì)對(duì)菜籽粕中菜籽蛋白的水解程度、菜籽肽的生成量以及硫苷的降解效果產(chǎn)生一定的影響。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，菌體不能得到充分生長(zhǎng)，產(chǎn)酶不足，菜籽蛋白的水解程度較低，多肽生成量少，硫苷的降解效果也較差；發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)，菌體會(huì)消耗過(guò)多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或出現(xiàn)衰亡，導(dǎo)致菜籽蛋白水解程度降低，多肽生成量減少，生產(chǎn)成本增加。由圖4可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵指標(biāo)具有顯著性影響。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，肽得率逐漸增加，在4～5d達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定；氮溶解指數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，在3～4d達(dá)到較高值，隨后出現(xiàn)較大幅度的下降，其原因可能是微生物生長(zhǎng)利用了其中的無(wú)機(jī)氮；硫苷降解率在發(fā)酵第3天后趨于穩(wěn)定，表明發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)并沒有對(duì)硫苷的降解效果產(chǎn)生多大的影響。研究還發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵5～6d期間，發(fā)酵基質(zhì)的顏色逐漸加深，并出現(xiàn)較為濃烈的氨味。因此，確定混菌發(fā)酵的較佳時(shí)間為4d。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化混菌發(fā)酵條件

2.3.1 響應(yīng)面分析法分析試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取混菌接種體積比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌發(fā)酵影響較大的這3個(gè)因素，以發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。各因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Coded levels of the variables tested in Box-Behnken design

為了最優(yōu)擬合二次多項(xiàng)回歸方程各項(xiàng)系數(shù)，依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，對(duì)影響菜籽肽得率的混菌發(fā)酵關(guān)鍵內(nèi)在因素進(jìn)行了15組試驗(yàn)，其中1～12為析因試驗(yàn)，13～15為中心試驗(yàn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率測(cè)定結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and measured and predicted values of rapeseed peptide yield

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng)，可得混菌接種體積比、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間與菜籽肽得率間的二次多項(xiàng)回歸方程：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3、4。

表3 菜籽肽得率二次多項(xiàng)式擬合模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results for the fitted quadratic polynomial model for rapeseed peptide yield

由表3回歸方程方差分析可知，二次多項(xiàng)式擬合模型具有高度的顯著性(P＝0.0002＜0.01)，P值越小，其因素影響越顯著；失擬項(xiàng)在α＝0.05水平上不顯著(P＝0.3729＞0.05)，說(shuō)明該模型的擬合檢驗(yàn)顯著；Y的變異系數(shù)較低(2.39%)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作具有一定的可信度；模型校正決定系數(shù)為0.9736，差異顯著，表明該模型擬合優(yōu)度好，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R2＝0.9906)，發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率僅有2.64%的總變異度不能由該模型解釋，所以此模型可應(yīng)用于菜籽肽發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。

表4 菜籽肽得率回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Significance test of regression coefficients for rapeseed peptide yield

對(duì)二次多項(xiàng)回歸方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明(表4)，在α＝0.01水平上，因素X2、X3對(duì)菜籽肽得率的線性效應(yīng)高度顯著，因素X22、X32對(duì)菜籽肽得率的曲面效應(yīng)高度顯著，說(shuō)明發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間皆對(duì)菜籽肽得率的影響高度顯著；在α＝0.05水平上，因素X1對(duì)菜籽肽得率的線性效應(yīng)顯著，因素X2X3的交互作用顯著，說(shuō)明發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間之間的交互作用對(duì)菜籽肽得率有顯著性影響，而混菌接種體積比對(duì)菜籽肽得率的線性影響顯著。通過(guò)顯著性檢驗(yàn)可以看出，各因素對(duì)菜籽肽得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，混菌發(fā)酵過(guò)程中各因素對(duì)菜籽肽得率的影響大小依次為發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和混菌接種體積比。

2.3.3 菜籽肽得率的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

通過(guò)二次多項(xiàng)回歸方程所作響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，可以直觀地反映出發(fā)酵條件對(duì)菜籽肽得率的影響。等高線圖還可揭示出各因素之間交互作用的顯著性。當(dāng)固定枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉接種體積比為4:1時(shí)，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間對(duì)菜籽肽得率影響交互作用的等高線圖和響應(yīng)曲面圖如圖5所示。此兩因素之間的交互作用顯著，這是因?yàn)榈雀呔€的形狀能夠反映出兩因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[17]。另外，在本實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，肽得率先增大后減小；隨著發(fā)酵溫度的增大，肽得率逐漸增大，并且在發(fā)酵溫度為32℃附近達(dá)到理論最大點(diǎn)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在4.3～5.0d，發(fā)酵溫度在31～33℃時(shí)，菜籽肽得率可達(dá)9.80%以上。

圖5 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間交互影響菜籽肽得率的曲面圖及其等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of rapeseed peptide yieldversus fermentation temperature and fermentation time

為了進(jìn)一步求得各因素的最佳條件組合，對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，當(dāng)響應(yīng)值Y有最大值時(shí)可求得各因素的水平：X1＝1.00、X2＝0.64、X3＝0.41，轉(zhuǎn)換后得到最佳發(fā)酵條件為：混菌接種體積比4:1、發(fā)酵溫度32.1℃、發(fā)酵時(shí)間4.64d(111h)，在此條件下預(yù)測(cè)混菌發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率模型預(yù)測(cè)值可達(dá)到9.93%。

2.3.4 模型驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的有效性，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)和二次多項(xiàng)回歸方程分析結(jié)果，在菜籽肽得率最高時(shí)的發(fā)酵條件下，進(jìn)行發(fā)酵重復(fù)實(shí)驗(yàn)，此條件下實(shí)際所得菜籽肽得率為9.85%，這與模型預(yù)測(cè)值(9.93%)僅相差0.81%，十分接近，可見該模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)際的發(fā)酵情況，由此表明響應(yīng)面分析法應(yīng)用于發(fā)酵條件的優(yōu)化是可行有效的。該優(yōu)化條件下所得發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率在培養(yǎng)基條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上相對(duì)提高了43.8%，比優(yōu)化前[18]相對(duì)提高了98.6%，發(fā)酵條件優(yōu)化效果較好。另外，在該優(yōu)化條件下測(cè)得實(shí)際的硫苷降解率為67.83%，也要高于培養(yǎng)基條件優(yōu)化后的62.09%和優(yōu)化前的60.87%，說(shuō)明發(fā)酵條件優(yōu)化后，菜籽粕中的硫苷降解效果比優(yōu)化前得到一定程度的改善。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以肽得率、氮溶解指數(shù)和硫苷降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的發(fā)酵條件，并以發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了菜籽肽的發(fā)酵工藝。通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定接種比例、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)菜籽肽得率有顯著影響，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析比較，確定了最佳發(fā)酵條件。

綜合枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽培養(yǎng)基條件優(yōu)化結(jié)果和發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果，最終得到最佳發(fā)酵工藝條件為：以菜籽粕和麩皮為基質(zhì)，菜籽粕添加量為95%，麩皮為5%，基質(zhì)與加水量質(zhì)量比為1:1.35，葡萄糖與KH2PO4的添加量分別為固液總質(zhì)量的0.50%和0.36%，在以上優(yōu)化培養(yǎng)基條件下調(diào)節(jié)、初始pH6.5、枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉同時(shí)接種、接種體積4:1、發(fā)酵溫度32.1℃、發(fā)酵時(shí)間4.64d (111h)。在此工藝條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率實(shí)際可達(dá)9.85%，比優(yōu)化前相對(duì)提高了98.6%，發(fā)酵效果較為明顯。同時(shí)測(cè)得該工藝條件下發(fā)酵產(chǎn)物的硫苷降解率為67.83%，也要高于優(yōu)化前的60.87%，這表明優(yōu)化后菜籽粕中的硫苷降解效果比優(yōu)化前得到一定程度的改善。

通過(guò)優(yōu)化枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的工藝條件得到較佳的發(fā)酵工藝條件參數(shù)，在該條件下經(jīng)發(fā)酵所得的發(fā)酵產(chǎn)品不僅具有較高含量的菜籽蛋白肽，而且其硫苷含量要遠(yuǎn)低于飼用菜籽粕的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可以作為飼料添加劑應(yīng)用于飼料工業(yè)中，這為菜籽蛋白資源的利用提供了參考。

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Optimization of Rapeseed Peptide Production by Mixed Solid-State Fermentation

JU Xing-rong1,2，WANG Xue-feng1，HE Rong1,2，WANG Li-feng2，YUAN Jian1
(1. Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Based on peptide yield, nitrogen solubility index (NSI) and glucosinolate degradation rate, the production conditions for rapeseed peptide by mixed solid-state fermentation using Bacillus subtilis and Actinomucor elegans preliminarily determined by one-factor-at-a-a-time method and further optimized by response surface analysis coupled with Box-Behnken design. The optimal fermentation conditons were 4:1 of Bacillus subtilis-to-Actinomucor elegans ratio, 32.1 ℃ of fermentation temperature, 4.64 d of fermentation time, resulting in a peptide yield of 9.85% and a glucosinolate degradation rate of 67.83%.

mixed solid-state fermentation；rapeseed peptide；process conditions；response surface methodology

TQ936.16

A

1002-6630(2012)11-0231-06

2011-12-17

國(guó)家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2009C10045)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目(cx(10)444；cx(10)234)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2010573)

鞠興榮(1957—)，男，教授，博士，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)及功能性成分研究與開發(fā)。E-mail：xingrongju@163.com