雞胸軟骨酶解產(chǎn)物的表征及對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

曹 慧，張忠慧，許時(shí)嬰

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2. 愛(ài)普香料集團(tuán)股份有限公司，上海 201809；3. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214036 )

雞胸軟骨酶解產(chǎn)物的表征及對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

曹 慧1，張忠慧2，許時(shí)嬰3

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2. 愛(ài)普香料集團(tuán)股份有限公司，上海 201809；3. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214036 )

目的：探討雞軟骨酶解產(chǎn)物的理化性質(zhì)及對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。方法：采用胃蛋白酶水解雞胸軟骨，研究軟骨酶解產(chǎn)物的組成及理化性質(zhì)，并建立大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，探討軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果：雞胸軟骨酶解產(chǎn)物的主要成分為Ⅱ型膠原，變性溫度為43.843℃，在pH值大于5.8，NaCl濃度大于0.9mol/L時(shí)，溶解度較低。口服雞胸軟骨酶解產(chǎn)物顯著抑制了RA大鼠的足掌腫脹，并降低了其血清抗Ⅱ型膠原(CII)抗體及滑膜炎性細(xì)胞因子的水平。結(jié)論：雞胸軟骨酶解產(chǎn)物可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞因子的表達(dá)、糾正失衡的Th1/Th2細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)及降低血清特異性抗CII抗體的水平對(duì)RA產(chǎn)生防治作用。

雞胸軟骨酶解產(chǎn)物；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；免疫調(diào)節(jié)功能；細(xì)胞因子

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis， RA)是臨床常見的多發(fā)病，是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病[1]，發(fā)病率約占我國(guó)人口的0.35%～0.4%。目前對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎尚沒(méi)有一個(gè)較好的治療方法，早期對(duì)關(guān)節(jié)行滑膜切除可以有效地延緩病變的發(fā)展過(guò)程，但如果病變已經(jīng)到了晚期，關(guān)節(jié)軟骨完全破壞，則除了行關(guān)節(jié)置換，別無(wú)其他選擇[2]，因此，如何通過(guò)改善機(jī)體的免疫功能達(dá)到預(yù)防RA的目的已經(jīng)成為全社會(huì)共同關(guān)注的焦點(diǎn)。

國(guó)外對(duì)RA發(fā)病機(jī)制及防治的研究已經(jīng)深入到分子和基因水平，他們認(rèn)為 RA的發(fā)生很可能是由于機(jī)體內(nèi)的T細(xì)胞因子引起關(guān)節(jié)組織內(nèi)部對(duì)特異性隱蔽抗原進(jìn)行的自身免疫反應(yīng)，而II型膠原是其主要的免疫原，因此通過(guò)口服未變性的II型膠原誘導(dǎo)免疫耐受可有效防治RA[3-4]。軟骨是畜禽加工的副產(chǎn)物，目前主要應(yīng)用于食品與飼料工業(yè)中，研究表明，雞胸軟骨中II型膠原的含量高達(dá)50%以上，但主要是以不可溶的原膠原形式存在[5]，因而本研究擬采用胃蛋白酶對(duì)雞胸軟骨進(jìn)行水解，使其變?yōu)榭扇苄訧I型膠原，并對(duì)水解產(chǎn)物的理化性質(zhì)及抗RA機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)SD 大鼠共40只，雄性，2～3月齡，體質(zhì)量為220～250g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)大鼠按清潔級(jí)飼養(yǎng)，溫度恒定于(25±0.5)℃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠自由攝食及水，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

雞胸軟骨 內(nèi)蒙古草原興發(fā)集團(tuán)；胃蛋白酶、II型膠原標(biāo)準(zhǔn)品、脂多糖、完全弗氏佐劑 美國(guó)Sigma公司；II型膠原酶 美國(guó)Gibco公司； 兔抗小鼠IgG 抗體 美國(guó)Novus公司；小牛血清 上海華美公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干擾素(interferon-γ，INF-γ)及白介素113(Interleukin-1β，IL-1β)試劑盒 南京建成生物有限公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自于上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱 德國(guó)Hereus公司；多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；CF7D2高速離心機(jī) 日本日立公司；Pyris差示掃描量熱儀 Perkin Elmer 公司；CL20-B型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 雞胸軟骨超微結(jié)構(gòu)的測(cè)定

將新鮮雞胸軟骨切成小塊，再按常規(guī)方法進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片(厚度約為2μm)及染色，采用JEM-2000EX透射電鏡觀察(加速電壓為10kV)。

1.3.2 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物制備流程及化學(xué)組成分析

商品雞胸軟骨→清洗→剔除肌肉、腱、骨膜等非軟骨物質(zhì)→冷凍粉碎→甲醇-氯仿(體積比2:1)脫脂→1g/100mL胃蛋白酶20℃酶解36h→ 3mol/L氯化鈉鹽析24h→10000r/min離心后取上清冷凍干燥→軟骨酶解產(chǎn)物

雞胸軟骨酶解產(chǎn)物中羥脯氨酸及II型膠原的測(cè)定按照Woessner法[6]進(jìn)行，糖胺聚糖的測(cè)定按照1,9-二甲基亞甲藍(lán)法[7]進(jìn)行，粗脂肪及灰分的測(cè)定分別按照國(guó)標(biāo)GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測(cè)定》和GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》進(jìn)行。

1.3.3 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物變性溫度的測(cè)定

雞胸軟骨切片至2mm×3mm大小，厚為0.5mm的薄塊，與已制備的軟骨酶解產(chǎn)物浸于pH7.4的溶液中，并在4℃平衡48h，取出吸干表面水分，置于差示掃描量熱儀(DSC)樣品容器中密封。溫度掃描范圍25～80℃，升溫速度：8℃/min。

1.3.4 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物溶解度的測(cè)定

將30mg雞胸軟骨酶解產(chǎn)物樣品分散于0.5mol/L的醋酸溶液中，采用0.1mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH(1.5～9.5)，并定容至10mL，緩慢攪拌1h后，以10000r/min離心15min，測(cè)定樣品上清液中膠原蛋白的含量。酶解產(chǎn)物溶解度的計(jì)算見式(1)。

溶解度與所測(cè)樣品中最高溶解度之比即為相對(duì)溶解率。

將軟骨酶解產(chǎn)物分散于0.5mol/L的醋酸溶液(pH2.5)中，分別添加不同量的NaCl，使NaCl的終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2mol/L，再按以上方法測(cè)定軟骨酶解產(chǎn)物的溶解度。相對(duì)溶解率的計(jì)算方法同上。

1.3.5 大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的建立

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的制作采用經(jīng)典方法[8]：將II型膠原標(biāo)準(zhǔn)品溶于0.05mol/L的醋酸中，與等量完全弗氏佐劑混和，混和后II型膠原的終質(zhì)量濃度為2mg/mL，將混合物充分乳化，以200μg/只的劑量，注射于大鼠左后足跖部，作為初次致敏。兩周后，以100μg/只的劑量進(jìn)行尾根部散點(diǎn)注射增強(qiáng)免疫[9]。致敏后大鼠隨機(jī)分成4組，每組8只。于初次致敏同時(shí)經(jīng)灌胃針灌注給予大鼠相應(yīng)實(shí)驗(yàn)品，每2d一次，共40d。具體分組為：正常組(未致敏大鼠)、致敏組、劑量組(6、60、600μg/(kg·d))。

1.3.6 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)大鼠腳掌厚度的影響

于致炎前采用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠腳掌厚度，并分別于初次致敏后第1、7、14、21、28天同法測(cè)量各組大鼠腳掌厚度。

1.3.7 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)大鼠血清抗CII抗體水平的影響

初次致敏后第35天，從大鼠尾部采血，分離血清，ˉ20℃存儲(chǔ)。以ELISA法檢測(cè)血清中抗CII抗體的水平。

1.3.8 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)大鼠滑膜細(xì)胞炎性因子分泌的影響

初次致敏后第40天，乙醚麻醉處死各組大鼠，無(wú)菌取下關(guān)節(jié)滑膜組織，用無(wú)Ca2+、Mg2+的Hank液反復(fù)沖洗，剪成小塊，移入含有10g/100mL小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液和0.4g/100mLⅡ型膠原酶(二者體積比為1:1)的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化6h，1000r/min離心5min后棄上清液，再加入適量0.25g/100mL胰蛋白酶消化30min，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，去除結(jié)締組織，洗滌、離心、鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞懸液10×106個(gè)/L。用含有5mg/L脂多糖(LPS)的培養(yǎng)液配制滑膜細(xì)胞懸液(5× 105個(gè)/mL)，加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，收集上清液，300×g離心10min、過(guò)濾，ˉ20℃保存。采用ELISA試劑盒測(cè)定滑膜細(xì)胞上清液中的IL-1β、INF-γ和TNF-α的水平。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)值以(±s)表示，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物的組成及理化性質(zhì)

2.1.1 雞胸軟骨的超微結(jié)構(gòu)

軟骨內(nèi)的Ⅱ型膠原主要由軟骨細(xì)胞所分泌，Ⅱ型膠原纖維具有堅(jiān)強(qiáng)的剛性，可作為軟骨組織的骨架，使軟骨呈一定的形狀。通過(guò)透射電鏡可以清晰的觀察到雞胸軟骨的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)和其中的軟骨細(xì)胞(圖1)，軟骨內(nèi)膠原纖維排列致密，直徑很細(xì)，并相互交織成網(wǎng)狀。軟骨細(xì)胞則呈卵圓形，細(xì)胞核呈圓形，核膜光滑，有典型的核仁。

圖1 原料軟骨的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of chicken sternal cartilage

2.1.2 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物的化學(xué)組成

表1 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物的主要組成Table 1 Main components of the pepsin hydrolysate of chicken sternal cartilage

采用胃蛋白酶水解雞胸軟骨后，對(duì)軟骨酶解產(chǎn)物的組成進(jìn)行了分析。由表1可見，經(jīng)過(guò)1.3.2節(jié)的提取步驟以后，雞胸軟骨酶解產(chǎn)物中的主要成分為II型膠原蛋白，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)已達(dá)到89.14%，而糖胺聚糖及脂肪的含量相對(duì)較低。

2.1.3 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物的變性溫度

研究表明，只有未變性的Ⅱ型膠原才可充分誘導(dǎo)免疫耐受[10]。天然狀態(tài)的Ⅱ型膠原由3條多肽鏈纏繞而成，當(dāng)其被酶解時(shí)，由于溫度和時(shí)間的作用，可能會(huì)導(dǎo)致氫鍵斷裂，天然構(gòu)象被破壞，這種狀態(tài)的變化過(guò)程都會(huì)伴隨著能量的變化[11]，因此采用差示掃描量熱儀(DSC)測(cè)定了軟骨酶解產(chǎn)物的穩(wěn)定性。由圖2可見，軟骨酶解產(chǎn)物及天然雞胸軟骨的變性溫度分別為43.843℃和44.113℃。膠原的收縮實(shí)際上是一個(gè)熔化現(xiàn)象，它具有一級(jí)相轉(zhuǎn)變的特征，也就是聚合物結(jié)晶區(qū)熔化的典型特征。變性溫度越高，說(shuō)明聚合物的結(jié)晶度越高，維持膠原纖維穩(wěn)定的分子間靜電相互作用和共價(jià)交聯(lián)越大。而當(dāng)膠原發(fā)生熱變性時(shí)，膠原鏈之間的穩(wěn)定性會(huì)被破壞，其三股螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)閱温菪Y(jié)構(gòu)。由本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可見，胃蛋白酶作用的軟骨酶解產(chǎn)物的變性溫度僅有微弱降低，這說(shuō)明在這說(shuō)明軟骨酶解產(chǎn)物在制備的過(guò)程中并沒(méi)有破壞其三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖2 雞胸軟骨及軟骨酶解物的變性溫度Fig.2 Denaturation temperatures of chicken sternal cartilage and its pepsin hydrolysate

2.1.4 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物的溶解性

圖3 pH值對(duì)雞胸軟骨酶解產(chǎn)物溶解性的影響Fig.3 Effect of pH on the solubility of the pepsin hydrolysate

由圖3可見，雞胸軟骨酶解產(chǎn)物在偏離等電點(diǎn)的酸性條件下，溶解度較高，隨著pH值的增加，溶解度降低，當(dāng)pH值為5.8左右時(shí)，其溶解度達(dá)到最低值，即為其等電點(diǎn)。這是因?yàn)檐浌敲附猱a(chǎn)物中的Ⅱ型膠原是十分典型的兩性聚電解質(zhì)，由于氨基端、羧基端、側(cè)鏈酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的存在，在水溶液中易電離為大分子離子，從而導(dǎo)致溶解度增高。

圖4 NaCl濃度對(duì)雞胸軟骨酶解產(chǎn)物溶解性的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on the solubility of the pepsin hydrolysate

由圖4可見，隨著NaCl濃度的增加，酶解產(chǎn)物的溶解度逐漸下降，當(dāng)NaCl的濃度到達(dá)0.9mol/L時(shí)，軟骨酶解產(chǎn)物的溶解度最低。這可能是由于溶液中高濃度的中性鹽離子有很強(qiáng)的水化能力，會(huì)奪取膠原蛋白分子的水化層，使其失水，發(fā)生聚集而沉淀析出。另外，NaCl是一種強(qiáng)電解質(zhì)，壓縮膠原分子的雙電層，膠原分子間靜電斥力減小，引起膠原分子之間聚集而沉淀，因而溶解度下降。

2.2 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

圖5 正常大鼠及致敏后的患病大鼠Fig.5 Rat paws before and after suffering from RA

2.2.1 大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的建立與對(duì)照組相比，接受Ⅱ型膠原注射誘導(dǎo)的大鼠的踝關(guān)節(jié)及掌趾部出現(xiàn)明顯紅腫(圖5)。除關(guān)節(jié)表現(xiàn)外，動(dòng)物還有輕度體毛脫落，活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，同時(shí)伴有局部皮溫升高。

2.2.2 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)大鼠足掌厚度的影響

圖6 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)大鼠足掌厚度的影響Fig.6 Effect of the pepsin hydrolysate on the thickness of paw of RA rats

初次致敏后的大鼠于次日就出現(xiàn)左后足發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹等急性炎癥表現(xiàn)，約14d后，除左后足關(guān)節(jié)炎癥加重外，其他腳掌和關(guān)節(jié)也陸續(xù)出現(xiàn)多關(guān)節(jié)炎癥。繼發(fā)性多關(guān)節(jié)炎病情于初次致敏約3周后達(dá)到高峰，此后隨病程延長(zhǎng)，多關(guān)節(jié)炎雖反復(fù)出現(xiàn)，但累計(jì)數(shù)量及程度均減輕。由圖6可見，與致敏組相比，雞胸軟骨酶解產(chǎn)物顯示出劑量依賴性抑制大鼠足腫脹的作用，在致炎后20d左右，600μg劑量組大鼠足掌厚度的下降程度達(dá)到峰值(P＜0.01)。

2.2.3 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)大鼠抗CII抗體的影響

圖7 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)血清抗CII抗體水平的影響Fig.7 Effect of the pepsin hydrolysate on the serum level of anticollagen type II antibody in RA rats

采用ELISA法檢測(cè)了大鼠血清中抗CII抗體的水平，結(jié)果如圖7所示。相比于致敏組大鼠，60μg(kg·d)和600μg(kg·d)劑量組的軟骨酶解產(chǎn)物顯著降低了RA大鼠的抗CII抗體的水平，其在490nm的OD值分別為0.842±0.184 (P＜0.05)和0.821±0.081(P＜0.05)。而6μg(kg·d)劑量組的軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)RA大鼠抗CII抗體的水平無(wú)顯著影響。

2.2.4 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)大鼠滑膜細(xì)胞炎性因子分泌的影響

圖8 雞胸軟骨酶解產(chǎn)物對(duì)炎性細(xì)胞因子的影響Fig.8 Effects of the pepsin hydrolysate on proinflammatory cytokines in RA rats

采用試劑盒測(cè)定了RA大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性細(xì)胞因子的水平，結(jié)果如圖8所示。RA大鼠均顯示出非平衡的細(xì)胞因子分泌狀態(tài)，其TNF-α、IFN-γ和IL-1β水平顯著高于正常組(P＜0.05)。相比于致敏組，600μg/ (kg·d)劑量組酶解產(chǎn)物顯著降低了滑膜液中TNF-α、IL-1β(P＜0.05)和 IFN-γ(P＜0.01)的水平，這提示其治療作用機(jī)理可能與抑制滑膜細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子及糾正Th1和Th2細(xì)胞平衡失調(diào)有關(guān)。

3 討 論

到目前為止，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎仍無(wú)有效的根治方法，也缺乏有效安全的防治措施。最近在研究人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的過(guò)程中，一些學(xué)者報(bào)道了口服未變性的II型膠原產(chǎn)生免疫耐受可使類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程受到抑制，無(wú)論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是臨床觀察中均發(fā)現(xiàn)令人鼓舞的結(jié)果[12-13]。然而天然軟骨中的II型膠原是不可溶的，只有去除其端肽時(shí)，才能轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘蘑蛐湍z原，在去除其端肽的過(guò)程中，II型膠原的天然三股螺旋可能被破壞。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，采用胃蛋白酶低溫處理的雞胸軟骨酶解產(chǎn)物未發(fā)生變性，同時(shí)在pH值小于5.8，NaCl濃度小于0.9mol/L時(shí)，保持較高的溶解性。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程與滑膜細(xì)胞功能改變有關(guān)[14-15]。在RA滑膜大量浸潤(rùn)的CD4+細(xì)胞(Th)中，以致炎性的Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，而具有相對(duì)保護(hù)作用的Th2細(xì)胞減少。Th1可促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化，并釋放大量炎性細(xì)胞因子(如INF-γ、TNF-α、IL-1等)，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)膠原酶、金屬蛋白酶的合成，增強(qiáng)細(xì)胞間黏附因子、血管細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致軟骨降解，造成滑膜成纖維細(xì)胞增殖，形成RA 特征性血管翳[16]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，口服軟骨酶解產(chǎn)物顯著抑制了RA大鼠的足掌腫脹，并降低了其血清抗CII抗體及滑膜炎性細(xì)胞因子的水平，這表明軟骨酶解產(chǎn)物可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞因子的表達(dá)、糾正失衡的Th1/Th2細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)及降低血清特異性抗CII抗體的水平對(duì)RA產(chǎn)生防治作用。

[1]RODA A , MANETTA A C, PIAZZA F, et al. A rapidand sensitive 384-microtiter wells format chemiluminescentenzyme immunoassay for clenbuterol[J]. Talanta, 2000, 52(2): 311-318.

[2]JOHN S, DAVIES N, WORTHINGTON J. Genes for rheumatoid arthritis offer new insights into disease mechanisms[J]. Drug Discovery Today: Disease Mechanisms, 2005, 2(3): 337-345.

[3]TAYLOR P C, FELDMANN M. Rheumatoid arthritis: pathogenic mechanisms and therapeutic targets[J]. Drug Discovery Today: Disease Mechanisms, 2004, 1(3): 289-295.

[4]VITAL E M , EMERY P. The development of targeted therapies in rheumatoid arthritis[J]. Journal of Autoimmunity, 2008, 31(3): 219-227.

[5]JU J H, CHO M L , JHUN J Y, et al. Oral administration of type II collagen suppresses IL-17-associated RANKL expression of CD4+T cells in collagen induced arthritis[J]. Immunology Letters, 2008, 117 (1): 16-25.

[6]WOESSNER J F. The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid[J]. Arch Biochem Biophys, 1961, 93(2): 440-447.

[7]PIEPER J S, HAFMANS T, VEERKAMP J H, et al. Development of tailor-made collagen-glycosaminoglycan matrices: EDC/NHS crosslinking, and ultrastructural aspects[J]. Biomate, 2000, 21(6): 581-593.

[8]MAYERS L K, TANG B AND BRAND D D, et al. Efficacy of modified recombinant type II collagen in modulating autoimmune arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2004, 50(9): 3004-3011.

[9]CHO Y G, CHO M L , MIN S Y. Type II collagen autoimmunity in a mouse model of human rheumatoid arthritis[J]. Autoimmunity Reviews, 2007, 7(1): 65-70.

[10]ZHAO Wei, TONG Tong, WANG Ling, et al. Chicken type II collagen induced immune tolerance of mesenteric lymph node lymphocytes by enhancing beta 2-adrenergic receptor desensitization in rats with collagen-induced arthritis[J]. International Immunopharmacology, 2011, 11(1): 12-18.

[11]GELSE K, PO..SCHL E, AIGNER T. Collagens-structure, function, and biosynthesis[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, 55(12): 1531-1546

[12]GARCIA G, KOMAGATA Y , SLAVIN A J, et al. Suppression of collagen-induced arthritis by oral or nasal administration of type II collagen[J]. Journal of Autoimmunity, 1999, 13(3): 315-324.

[13]李學(xué)義, 朱平, 王彥紅, 等. 重組人II型膠原250-270多肽的表達(dá)及活性研究[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2003, 23(2): 152-154.

[14]MATSUMOTO T, AMETANI A, HACHIMURA S, et al. Intranasal administration of denatured type II collagen and its fragments can delay the onset of collagen-induced Arthritis[J]. Clinical Immunology and Immunopathology, 1998, 88(1): 70-79.

[15]UCHIYAMA Y, KOIKE N. Anemia in monkey collagen-induced arthritis is correlated with serum IL-1, but not TNFα[J]. Rheumatology International, 2008, 28(9): 879-883.

[16]FRIDKIS-HARELI M, ROSLONIEC E F , FUGGER L, et al. Synthetic peptides that inhibit binding of the collagen type II 261-273 epitope to rheumatoid arthritis-associated HLA-DR1 andˉDR4 molecules and collagen-specific T-cell responses[J]. Human Immunology, 2000, 61(7): 640-650.

Characterization of Pepsin Hydrolysate of Chicken Sternal Cartilage and Its Immunoregulatory Function in Rats with Rheumatoid Arthritis

CAO Hui1，ZHANG Zhong-hui2，XU Shi-ying3
(1.Medical Equipment and Food Institute, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China；2. Apple Flavor & Fragrance Group Co. Ltd., Shanghai 201809, China；3. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214036, China)

Purpose: To investigate physicochemical properties of the pepsin hydrolysate of chicken sternal cartilage and its immunoregulatory function in rats with rheumatoid arthritis (RA). Methods: RA was induced in rats by collagen type II injections. Results: The pepsin hydrolysate consisted mainly of collagen type II with a denaturation temperature of 43.843℃. However, the solubility was low at pH above 5.8 and NaCl concentrations above 0.9 mol/L. Oral administration of the hydrolysate decreased significantly the swelling of paws, the serum level of anti-collagen type II antibody and secretion of proinflammatory cytokines in RA rats. Conclusion: The pepsin hydrolysate can prevent and treat RA probably by regulating the expression of Th1 and Th2 cytokines, correcting the imbalance of Th1/Th2 cytokines network, and decreasing the serum concentration of anti-collagen type II antibody.

chicken sternal cartilage hydrolysate；rheumatoid arthritis；immunoregulatory function；cytokines

TS201.2

A

1002-6630(2012)03-0243-05

2011-06-30

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (11ZR1424400)

曹慧(1976—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)楣δ苄耘淞霞疤砑觿-mail：caohuian@yahoo.com.cn