青稞酒發(fā)酵過(guò)程中生物胺動(dòng)態(tài)變化

杜木英，陳宗道，闞建全，Judit BECZNER，Agnes BARATH，Anna HALASZ

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. Central Food Research Institute, Budapest H-1022, Hungary)

青稞酒發(fā)酵過(guò)程中生物胺動(dòng)態(tài)變化

杜木英1，陳宗道1，闞建全1，Judit BECZNER2，Agnes BARATH2，Anna HALASZ2

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. Central Food Research Institute, Budapest H-1022, Hungary)

對(duì)青稞酒發(fā)酵過(guò)程中生物胺的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行研究。利用氨基酸自動(dòng)分析液相色譜法測(cè)定青稞酒不同發(fā)酵階段中7種生物胺的含量，來(lái)評(píng)價(jià)發(fā)酵環(huán)境以及控制合理發(fā)酵過(guò)程和發(fā)酵終產(chǎn)物的質(zhì)量。結(jié)果表明：青稞原料中不含組胺，但是青稞酒醅及成品青稞酒中都含有組胺。傳統(tǒng)發(fā)酵和多菌種發(fā)酵兩種發(fā)酵方式青稞酒的生物胺含量變化規(guī)律是：腐胺及胍丁胺的含量變化隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈下降趨勢(shì)；組胺及酪胺的含量隨發(fā)酵進(jìn)程逐漸上升，尤其是酪胺，上升趨勢(shì)明顯，多菌種發(fā)酵由2.98μg/g上升至5.36μg/g，傳統(tǒng)發(fā)酵由5.97μg/g 上升至11.67μg/g。其余各種生物胺含量變化不明顯，發(fā)酵過(guò)程的生物胺總量變化也不顯著。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的青稞酒醅中的生物胺總量范圍在53.44～72.56μg/g，不存在生物胺安全問(wèn)題。

青稞酒；發(fā)酵；生物胺變化

以青稞為主要原料釀造的青稞酒是青藏高原的特色飲品，酒味酸甜，酒香濃郁，類似內(nèi)地的米酒或醪糟酒，初飲有點(diǎn)甘苦、辛辣，但咽下后頓覺(jué)有余香、回味，不傷胃，口不干，醒酒快，有營(yíng)養(yǎng)，口感好的特點(diǎn)，深受廣大藏族人民的喜愛(ài)。

生物胺是一類堿性含氮化合物，廣泛地存在于葡萄酒、啤酒等發(fā)酵酒中[1-4]。當(dāng)機(jī)體攝入高濃度的生物胺后，將產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，可能引起頭痛、呼吸紊亂、心悸等不良癥狀，嚴(yán)重情況下，可以引起大腦出血，甚至死亡。哺乳動(dòng)物的腸道和消化道具有一定的解毒功能，可以消除飲食中攝入的微量生物胺的毒性，在酶的作用下單胺或多胺的氨基被氧化，從而達(dá)到解毒目的。但酒類發(fā)酵食品中的酒精和乙醛能抑制這些酶的活性，從而降低脫毒效率。因此，生物胺從食品安全及毒性毒理角度來(lái)說(shuō)，都是比較重要的成分[5-10]。生物胺在中外傳統(tǒng)發(fā)酵食品中含量也越來(lái)越受到關(guān)注[11-16]，但是有關(guān)青稞酒中生物胺種類和含量的報(bào)道目前還缺乏。生物胺分析方法包括比色法、氨基酸分析法、色譜法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[17-23]。本實(shí)驗(yàn)利用氨基酸自動(dòng)分析液相色譜法測(cè)定青稞酒不同發(fā)酵階段中7種生物胺的含量，從生物胺的角度考察青稞酒的安全性，以期對(duì)青稞酒的安全發(fā)酵起到一定指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞：藏青320，由西藏龍湖工貿(mào)有限公司提供。青稞酒傳統(tǒng)優(yōu)良酒曲，采購(gòu)于西藏拉薩附近的藏民家及附近作坊，酒曲采集后，立即用無(wú)菌的塑料袋包裝后置于冰袋中運(yùn)輸，置于實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱中保藏備用。多菌種曲：實(shí)驗(yàn)室自制的米根霉純種曲和酵母固體曲復(fù)配而成。

腐胺(putrescine，Put)、組胺(histamine，Hist)、尸胺(cadaverine，Cad)、亞精胺(spermidine，Spd)、胍丁胺(agmatine，Agm)、精胺(spermine，Sper)、酪胺(tyramine，Tyrm) 美國(guó)Sigma公司；高氯酸、鹽酸、檸檬酸鉀(色譜純) 成都市科龍化工試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC 2000氨基酸自動(dòng)分析儀(包括色譜系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、Shimadzu CR-2AX記錄和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) 德國(guó)Biotronik公司；Dowex W50x8陽(yáng)離子交換樹脂柱 美國(guó)Dow化學(xué)公司。

1.3 青稞酒釀造工藝流程

1.3.1 傳統(tǒng)青稞酒的釀造工藝流程

青稞→浸泡→蒸煮→攤涼→拌入青稞酒傳統(tǒng)酒曲(原料青稞質(zhì)量的0.4%～0.5%)→28～30℃糖化發(fā)酵72h→青稞酒醅→加涼開(kāi)水浸泡4h以上→過(guò)濾→青稞酒

1.3.2 多菌種發(fā)酵青稞酒

酒曲用多菌種曲接種，用量為原料青稞質(zhì)量的5%，其余步驟同傳統(tǒng)發(fā)酵。

1.4 兩種發(fā)酵方式發(fā)酵青稞酒

采用傳統(tǒng)酒曲發(fā)酵與接種多菌種曲發(fā)酵，在發(fā)酵期間，每隔12h均勻取樣，用組織粉碎機(jī)粉碎，作為實(shí)驗(yàn)的樣品，3次重復(fù)。

1.4.1 樣品處理

固態(tài)樣品：取10g粉碎后的樣品，用0.6mol/L的高氯酸提取兩次，每次25mL，合并提取液，上已處理好的陽(yáng)離子交換樹脂柱，除去游離氨基酸并濃縮樣品。洗出液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘?jiān)芙庥?.1mL 0.01mol/L HCl中，過(guò)0.45μm微孔濾膜，供上機(jī)分析測(cè)定。

液態(tài)樣品：液體樣品不經(jīng)過(guò)萃取處理，直接上柱除雜和濃縮，其他步驟同固體樣品處理后，供上機(jī)分析測(cè)定。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：BTC3118陽(yáng)離子交換樹脂柱(K+型，0.4cm× 10cm)，流動(dòng)相：檸檬酸鉀緩沖溶液，柱溫：67℃，流速40mL/h，檢測(cè)波長(zhǎng)570nm。

洗脫程序：采用3種不同pH值和離子濃度的緩沖溶液洗脫，共6個(gè)步驟：注入樣品(上樣)，用pH5.8的檸檬酸鉀緩沖液(0.4mol/L)洗脫3min；用pH5.65的檸檬酸鉀緩沖液(1.3mol/L)洗脫12min；繼續(xù)用pH5.65的檸檬酸鉀緩沖液(1.3mol/L)洗脫8min后，淋出液開(kāi)始與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)；用pH5.43檸檬酸鉀緩沖液(2.5mol/L)洗脫40min；0.6mol/L KOH活化再生柱子；用pH5.8檸檬酸鉀緩沖液(0.4mol/L)洗脫平衡20min。

1.4.3 微生物檢測(cè)方法

菌落總數(shù)測(cè)定參照GB 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[24]；霉菌和酵母測(cè)定參照GB 4789.15—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[25]；大腸菌群測(cè)定參照GB 4789.3—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》[26]。致病菌：沙門氏菌測(cè)定參照GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[27]；志賀氏菌測(cè)定參照GB 4789.5—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌檢驗(yàn)》[28]；金黃色葡萄球菌測(cè)定參照GB 4789.10—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[29]；乳酸菌測(cè)定參照GB/T 4789.35—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[30]；腸桿菌測(cè)定：在紫紅膽汁葡萄糖瓊脂(VRBG-Violet Red Bile Glucose Agar, CM485,Oxoid, England)上，37℃條件下培養(yǎng)2d后計(jì)數(shù)。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都是3次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的平均值，并用Origin8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞酒發(fā)酵過(guò)程中生物胺總量的變化

發(fā)酵酒醅按照1.4.1節(jié)預(yù)處理后，選用不同pH值和離子濃度的緩沖溶液洗脫程序，結(jié)果較為理想，7種生物胺色譜圖較為理想，分離效果好，基本能達(dá)到基線分離，且理論塔板數(shù)能達(dá)到1500左右。

圖1 發(fā)酵酒醅中生物胺總含量的變化Fig.1 Changes of total biogenic amine content during fermentation

對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的青稞酒醅進(jìn)行檢測(cè)，7種生物胺均能檢出，如圖1所示，發(fā)酵過(guò)程中生物胺總量變化不顯著，在53.44～72.56μg/g范圍之間，但都在發(fā)酵開(kāi)始至48h內(nèi)遞減，然后再遞增，到72h發(fā)酵終了時(shí)多菌種曲發(fā)酵生物胺總量為66.63μg/g，傳統(tǒng)發(fā)酵為55.85μg/g。

生物胺的產(chǎn)生和聚積取決于多種因素，如特殊細(xì)菌(腸球菌、乳桿菌、發(fā)酵劑或非發(fā)酵劑)、酶和底物(游離氨基酸)的存在，適當(dāng)?shù)妮o助因子(磷酸吡哆醛)，適宜的環(huán)境條件等，可通過(guò)這些因素來(lái)控制生物胺含量，使其保持在安全線以下，達(dá)到食品質(zhì)量與安全標(biāo)準(zhǔn)[31]。

2.2 青稞酒發(fā)酵過(guò)程中酪胺和組胺含量的變化

生物胺引起的食品安全問(wèn)題，也就是生物胺的毒性作用。其中組胺對(duì)人類的健康影響最大[32]，其次是酪胺?？诜?～40mg組胺產(chǎn)生輕微中毒癥狀，超過(guò)40mg產(chǎn)生中等中毒癥狀，超過(guò)100mg產(chǎn)生嚴(yán)重中毒癥狀?？诜野烦^(guò)100mg引起偏頭痛，超過(guò)1080mg引起中毒性腫脹。

圖2 發(fā)酵酒醅中酪胺和組胺的含量變化Fig.2 Changes of tyramine and histamine content during fermentation

由圖2可見(jiàn)，多菌種曲與傳統(tǒng)曲兩種發(fā)酵方式發(fā)酵過(guò)程中，酪胺和組胺的含量都隨發(fā)酵進(jìn)程逐漸上升，尤其是酪胺，上升趨勢(shì)明顯，多菌種發(fā)酵由2.98μg/g上升至5.36μg/g，傳統(tǒng)發(fā)酵由5.97μg/g上升至11.67μg/g。但是酪胺和組胺的含量都很低，發(fā)酵72h的青稞酒醅中，多菌種曲與傳統(tǒng)曲發(fā)酵后酪胺含量分別占生物胺總量的8.04%和20.90%，組胺含量分別占生物胺總量的2.51%、5.46%，多菌種曲發(fā)酵兩種生物胺含量和所占生物胺總量的百分比都低于傳統(tǒng)曲發(fā)酵的青稞酒酒醅。說(shuō)明多菌種曲發(fā)酵降低了酪胺和組胺的含量，從生物胺方面多菌種發(fā)酵的青稞酒比傳統(tǒng)發(fā)酵青稞酒安全性更高，這可能是發(fā)酵過(guò)程中微生物菌相差別造成的。

表1 傳統(tǒng)青稞酒及青稞酒曲微生物指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Microbiological indexes of highland barely, fermentedhighland barley and highland barley wine

如表1所示，用取自同一藏民家的青稞，對(duì)傳統(tǒng)青稞酒以及青稞酒曲做微生物檢測(cè)，結(jié)果表明：傳統(tǒng)青稞酒曲中含有大量乳酸菌和腸桿菌等，腸桿菌產(chǎn)生脫羧酶催化氨基酸脫羧產(chǎn)生生物胺，這些脫羧酶即使在細(xì)胞死亡后仍具有活性。多種微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶較多、活力強(qiáng)，使氨基酸脫去羧基而生成生物胺所致，所以傳統(tǒng)曲發(fā)酵的酪胺和組胺的含量比多菌種曲發(fā)酵的高。

研究發(fā)現(xiàn)，酒曲中的微生物數(shù)量及種類都多于青稞酒，說(shuō)明在青稞酒的發(fā)酵過(guò)程中，微生物如酵母、乳酸菌在同一醪液內(nèi)發(fā)酵，在營(yíng)養(yǎng)利用上互相競(jìng)爭(zhēng)性抑制。多種微生態(tài)群落的演替過(guò)程和各菌種間的共生、共酵、代謝調(diào)控過(guò)程，并具有反饋抑制作用，而且直接影響酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。傳統(tǒng)工藝的魅力，在于多種微生物群(包括酵母菌、細(xì)菌等)參與發(fā)酵，不但賦予酒特有的風(fēng)味，而且由于多種微生物的代謝產(chǎn)物豐富，有利于酒的香氣和口感。但要釀造好的酒，就要利用好有利微生物，抑制有害微生物的作用。乳酸菌中乳球菌、明串珠菌中的一些菌株，以及乳桿菌中的布氏乳桿菌、消化乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、香腸乳桿菌、巴伐利亞乳桿菌、同型腐酒乳桿菌、路氏乳桿菌和清酒乳桿菌的一些菌株產(chǎn)生最多的一種生物胺是酪胺[33]。由表1可知，從青稞到最后的青稞酒，乳酸菌數(shù)量明顯增高。由圖2a可知，在發(fā)酵過(guò)程中，酪胺含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，因?yàn)槎喾N乳酸菌均可產(chǎn)生酪胺，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌數(shù)量的增長(zhǎng)，所以酪胺含量在發(fā)酵期間不斷升高。

微球菌屬和葡萄球菌屬中的某些菌種具有組氨酸脫羧酶的活性。據(jù)報(bào)道，木糖葡萄球菌中76%的菌株能生產(chǎn)組胺。由表1可知，青稞和酒曲中均含有葡萄球菌，葡萄球菌產(chǎn)生組胺并且不斷積累，如圖2b所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，組胺含量不斷增加。

從青稞酒生產(chǎn)過(guò)程中篩選優(yōu)良微生物制作的多菌種酒曲用于發(fā)酵，能夠抑制有害微生物的生長(zhǎng)、繁殖和外界微生物的侵入，保障發(fā)酵的正常進(jìn)行和順利完成，提高青稞酒的品質(zhì)，特別是降低了酪胺和組胺的含量，確保發(fā)酵食品的安全。

2.3 青稞酒發(fā)酵過(guò)程中胍丁胺、精胺、亞精胺含量的變化

多胺化合物在生物體的生長(zhǎng)過(guò)程中，能促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，加速生物的生長(zhǎng)發(fā)育。如圖3所示，多菌種發(fā)酵和傳統(tǒng)曲發(fā)酵青稞酒過(guò)程中胍丁胺的含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈下降趨勢(shì)，精胺、亞精胺含量變化趨勢(shì)不明顯。但是胍丁胺是發(fā)酵過(guò)程中含量最高的生物胺，發(fā)酵終了酒醅中胍丁胺含量在多菌種發(fā)酵和傳統(tǒng)發(fā)酵方式下分別是28.72μg/g和17.49μg/g，含量分別占生物胺總量的43.10%和31.32%。多菌種發(fā)酵過(guò)程中，3種多胺之和占生物胺總量的74.34%，而傳統(tǒng)曲發(fā)酵3種多胺之和占生物胺總量的65.39%。說(shuō)明多菌種發(fā)酵產(chǎn)生的生物胺主要是對(duì)人體沒(méi)有直接毒性的多聚胺，因此這樣的發(fā)酵是安全的。

2.4 青稞酒發(fā)酵過(guò)程中腐胺和尸胺含量變化

圖4 發(fā)酵酒醅中腐胺和尸胺的含量變化Fig.4 Changes of putrescine and cadaverine content during fermentation

如圖4所示，腐胺的含量變化隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈下降趨勢(shì)；發(fā)酵72h的青稞酒醅中，多菌種曲與傳統(tǒng)曲兩種發(fā)酵方式的腐胺為9.14μg/g和3.96μg/g，腐胺含量分別占兩種發(fā)酵方式的生物胺總量的13.72%和7.09%。尸胺含量變化趨勢(shì)不明顯。

腐胺和尸胺等雙胺與其他血管胺(酪胺、組胺、色胺、苯乙胺)不同，對(duì)人類健康并無(wú)不利的影響，但是它們卻能通過(guò)抑制脫毒酶、雙胺氧化酶和羥甲基轉(zhuǎn)換酶的活性而潛在的影響組胺含量。而且，它們的積累與產(chǎn)品的微生物品質(zhì)下降相關(guān)聯(lián)，組胺的毒性在它們的存在條件下有增強(qiáng)的趨勢(shì)。

2.5 青稞原料及成品青稞酒中生物胺的含量

表2 青稞及青稞發(fā)酵產(chǎn)品中的生物胺含量Table 2 Content of biogenic amines in highland barely, fermented highland barley and highland barley wine

如表2所示，青稞原料中不含組胺，但是青稞酒醅及成品青稞酒中都含有組胺，分析是青稞酒曲中的腸桿菌發(fā)酵生成的，腸桿菌產(chǎn)生脫羧酶催化氨基酸脫羧產(chǎn)生生物胺，這些脫羧酶即使在細(xì)胞死亡后仍具有活性。但是不論是對(duì)食物安全造成最大威脅的組胺和酪胺含量或者是生物胺總量都低于食品中的限量，因此，青稞酒的優(yōu)良酒曲發(fā)酵和多菌種曲發(fā)酵都不存在生物胺的安全性問(wèn)題，所得青稞酒產(chǎn)品從生物胺角度評(píng)價(jià)是安全的，多菌種曲發(fā)酵青稞酒較傳統(tǒng)曲發(fā)酵的青稞酒安全性更高。

3 結(jié) 論

青稞酒發(fā)酵過(guò)程中能檢測(cè)到腐胺、組胺、尸胺、亞精胺、胍丁胺、精胺及酪胺7種生物胺，生物胺總量變化不顯著，組胺及酪胺的含量隨發(fā)酵進(jìn)程逐漸上升，多菌種發(fā)酵的組胺及酪胺的含量均低于傳統(tǒng)發(fā)酵。腐胺和胍丁胺的含量變化隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈下降趨勢(shì)；其余各種生物胺含量變化不明顯。多菌種曲發(fā)酵青稞酒較傳統(tǒng)曲發(fā)酵的青稞酒安全性更高。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的青稞酒醅中的生物胺總量范圍在53.44～72.56μg/g，不存在生物胺安全問(wèn)題。

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[24]GB 4789.2—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定[S].

[25]GB 4789.15—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)[S].

[26]GB 4789.3—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)[S].

[27]GB 4789.4—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)[S].

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[29]GB 4789.10—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)[S].

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Dynamic Changes of Biogenic Amines in Highland Barley Wine during Fermentation

DU Mu-ying1，CHEN Zong-dao1，KAN Jian-quan1，Judit BECZNER2，Agnes BARATH2，Anna HALASZ2
(1. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment in Agricultural Products Preservation(Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Central Food Research Institute, Budapest H-1022, Hungary)

In this study, dynamic changes of biogenic amines in highland barley wine during fermentation were investigated. The content of seven different biogenic amines at different fermentation stages was determined using an amino acid analyzer to evaluate the fermentation environment and reasonably control the fermentation process and the quality of final fermentation products. The results showed that highland barley did not contain histamine, but both fermented highland barley and highland barley wine contained histamine. The dynamic change pattern of biogenic amines during fermentation for both traditional fermentation and inoculated fermentation was as follows: putrescine and agmatine contents declined while histamine and tyramine content increased gradually as the fermentation progressed. Tyramine content increased significantly from 2.98μg/g to 5.36μg/g during multi-strain fermentation and from 5.97μg/g to 11.67μg/g by traditional fermentation. The content of other types of biogenic amines and the total biogenic amines did not change significantly during fermentation. The variation of total biogenic amines was 53.44ˉ72.56μg/g, which is within the safe limit of biogenic amines.

highland barley wine；fermentation；biogenic amine composition

TS201.6

A

1002-6630(2012)03-0163-05

2011-09-30

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(XDJK2009C040)；西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目(SWUB2008068)；科技部2005—2006年度中國(guó)與匈牙利政府間科技合作項(xiàng)目(CHN-12/2004)

杜木英(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锱c發(fā)酵工程。E-mail：muyingdu@swu.edu.cn