小黃魚免疫肽制備條件的響應面優(yōu)化

何佳易，徐 鑫,*，劉國艷，蔡麗麗，魏曉蕊，滿其琪，盧正竹

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.連云港正榮食品添加劑廠，江蘇 連云港 222000)

小黃魚免疫肽制備條件的響應面優(yōu)化

何佳易1，徐 鑫1,*，劉國艷1，蔡麗麗1，魏曉蕊1，滿其琪1，盧正竹2

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.連云港正榮食品添加劑廠，江蘇 連云港 222000)

優(yōu)化胰蛋白酶(PTN 6.0S)酶解小黃魚制備免疫肽的制備條件。MTT法檢測酶解產(chǎn)物對小鼠脾細胞的增殖程度，并以脾細胞增殖指數(shù)(SI)為指標，通過單因素試驗及響應曲面法優(yōu)化酶解條件。結(jié)果顯示：在溫度41.66℃、時間18.24h、底物質(zhì)量濃度6g/100mL、酶與底物的質(zhì)量比(酶底比)3.13‰條件下，模擬得出多肽產(chǎn)物的SI值為0.387。驗證實驗發(fā)現(xiàn)，在溫度42℃、時間18.2h、底物質(zhì)量濃度6g/100mL、酶底比3‰條件下，SI值為0.369± 0.003，略低于模擬值，所得條件較為理想。

小黃魚；免疫肽；響應曲面法；MTT法

小黃魚在我國海域有著廣泛的分布，屬大宗型海洋魚資源，產(chǎn)量高，但開發(fā)利用率較低，主要為罐頭等初級加工類產(chǎn)品，深加工產(chǎn)品規(guī)模與其產(chǎn)量有著巨大的差距，其作為蛋白來源用于制備生物活性肽的研究尚未見報道。

近40年來，免疫肽因具有與內(nèi)源肽相類似的信號傳導作用[1-3]，已成為提高機體免疫力研究領域的熱點[4-6]。由于活性肽段“隱含”在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，目前主要采用酶解技術進行制備。該方法受酶種類、底物及酶反應條件等諸多因素影響[7]，所以，研究并控制酶法制備的工藝條件尤為重要。

胰蛋白酶是酶法制肽的常用酶制劑之一，一定程度上可模擬食物在腸道的消化分解過程，更重要的是，該酶水解多種食源蛋白均能得到不同活性的免疫肽。首例免疫肽(六肽)即由人乳蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解制得[8]；而該酶的專一特性也利于獲得理想的目標產(chǎn)物，如酪蛋白酶解產(chǎn)物中的酪蛋白磷酸肽[9]。所以，綜合考慮后，本實驗選取胰蛋白酶(PTN6.0S)為工具酶。

本實驗以脫脂酶解產(chǎn)物的脾細胞增殖指數(shù)(stimulating index，SI)值為指標，經(jīng)單因素試驗及響應曲面法，分析并優(yōu)化免疫肽的制備條件。以期對于規(guī)?；阜ㄖ苽涿庖呋钚噪墓に嚄l件的選擇具有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小黃魚(蛋白質(zhì)含量約20%)，購自連云港市連云區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

ICR小鼠，5～6周齡，揚州大學醫(yī)學比較中心。

胰蛋白酶PTN6.0S(1.89×104U/g) 丹麥諾維信公司；RPMI-1640粉末、含谷氨酰胺 美國Gibco公司；D-Hank,s洗液、青霉素、鏈霉素混合液 生工生物工程(上海)有限公司；小牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；ConA、HEPES、MTT、臺盼蘭粉末 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

524型恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦公司；RV10 Basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Ika公司；5804R高速離心機 德國Eppendorf公司；Delta320 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Alpha1-2 LD Plus冷凍干燥儀 德國Christ公司；ZHJH-C2112B超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；96孔細胞培養(yǎng)板 美國Costa公司；Ex-800酶標儀 美國Bio-Tek公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱 德國賀利氏公司；DM2000顯微鏡 德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽樣品制備工藝

清洗小黃魚→去除內(nèi)臟→絞肉成糜→雙蒸水混勻→加酶→恒溫酶解→滅酶(沸水浴，10min)→離心(10000r/min，4℃，15min)→取上清→濃縮→冷凍干燥→凍干粉脫脂→揮干溶劑→脫脂樣品

1.3.2 酶解條件的單因素試驗設計

1.3.2.1 不同底物質(zhì)量濃度對細胞增殖活性的影響

將底物質(zhì)量濃度設為1、2、3、4、5、6、7g/100mL，按酶底比1‰，pH7.0，溫度50℃反應8h，測定脾細胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.2.2 不同pH值對細胞增殖活性的影響

將pH值設為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，按底物質(zhì)量濃度3g/100mL，酶底比1‰，溫度50℃反應8h，測定脾細胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.2.3 不同溫度對細胞增殖活性的影響

將溫度設為35、40、45、50、55、60、65℃，按底物質(zhì)量濃度3g/100mL，酶底比1‰，pH7.0反應8h，測定脾細胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.2.4 不同酶底比對細胞增殖活性的影響

將酶底比設為0.1‰、0.2‰、0.4‰、1‰、2‰、4‰、10‰，按底物質(zhì)量濃度3g/100mL，pH7.0，溫度50℃反應8h，測定脾細胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.2.5 不同時間對細胞增殖活性的影響

將時間設為3、8、13、18、23、28、33h，按底物質(zhì)量濃度3g/100mL，酶底比1‰，pH7.0，溫度50℃反應，測定脾細胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.3 酶解工藝條件的響應曲面試驗設計

根據(jù)Box-Behnken設計原理，以細胞刺激指數(shù)(SI)為響應值，選取溫度、時間、底物質(zhì)量濃度、酶底比為影響因素，進行四因素三水平分析，共29個試驗點，其中5個為中心點。

表1 響應面分析試驗設計表Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.4 脾細胞增殖活性測定[10-13]

采用MTT法，并對其進行一定改良后用于實驗。無菌獲取小鼠脾細胞，活細胞比例保證在95%以上，調(diào)整濃度至2×106個/mL，在96孔板中設空白組、對照組和樣品組，3組分別為細胞溶液、細胞+ConA溶液、細胞+ConA+樣品溶液，各組均設3個平行，置于含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱，終止培養(yǎng)前4h加入適量無菌MTT溶液，繼續(xù)孵育至結(jié)束。取出培養(yǎng)板，充分離心后，棄上清，加入HCl-異丙醇溶液充分溶解結(jié)晶，離心取上清，于490nm波長處測其OD值。細胞增殖活性以刺激指數(shù)(SI)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗各值均為3個平行數(shù)據(jù)的均值，響應曲面試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.0軟件繪圖并作方差和顯著性分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗樣品的細胞增殖活性

檢測樣品免疫活性時，以ConA組刺激指數(shù)SI為陽性對照，SI值為0.096±0.0038。

2.1.1 不同底物質(zhì)量濃度對細胞增殖活性的影響

圖1 不同底物質(zhì)量濃度對SI值的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖1可知，底物質(zhì)量濃度在1～4g/100mL時，SI值明顯上升，但4g/100mL時的上升幅度有所減小；當質(zhì)量濃度大于4g/100mL時，SI值開始下降。有學者報道，酶解程度與底物質(zhì)量濃度呈正相關[14]，即可被蛋白酶切斷的肽鍵數(shù)目是酶解工藝的主要影響因素。增加底物質(zhì)量濃度，即增加酶的初始敏感肽鍵數(shù)目，延緩了免疫活性肽段的釋放。

2.1.2 不同pH值對細胞增殖活性的影響

圖2 不同pH值對SI值的影響Fig.2 Effect of pH on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖2可知，pH6.0～7.0時，SI值上升，pH值繼續(xù)增大，SI值明顯降低。蛋白質(zhì)對pH值的變化較為敏感，可能與pH值影響酶活性部位和底物蛋白的解離有關，抑制了活性多肽的釋放[15]。林偉峰[7]學者在可控酶解魚蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，pH值恒定利于提高肽得率，有必要尋找工藝中酶的較適pH值。當pH值為7.0時，SI值明顯最大，所以，在響應曲面試驗中，pH值將恒定在7.0。另外，在細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的pH值對細胞活力有一定影響[16]，所以，為尋找酶解工藝中更適pH值，今后的實驗中嘗試在冷凍干燥前將酶解液調(diào)至pH7.0，以防對細胞活力的影響。

2.1.3 不同酶解溫度對細胞增殖活性的影響

圖3 不同酶解溫度對SI值的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖3可知， 45℃和50℃時，酶解產(chǎn)物具有較強的細胞增殖活性。40℃時，利于酶的激活，SI值明顯上升。55℃時，SI值有所下降，但根據(jù)諾維信公司提供的產(chǎn)品資料顯示，此溫度為胰蛋白酶(PTN 6.0S)的最適溫度。由此表明，選擇酶解工藝的溫度時，不僅要考慮酶的最適溫度，還要考慮產(chǎn)物活性。

2.1.4 不同酶底比對細胞增殖活性的影響

圖4 不同酶底比對SI值的影響Fig.4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖4可知，酶底比在0.1‰～2‰時，酶解產(chǎn)物的細胞增殖活性隨酶用量的提高而增強，且增幅明顯；繼續(xù)提高酶用量，SI值下降。在此酶解過程中，氨基氮含量卻隨酶用量的增加而增加(數(shù)據(jù)未給出)，這也提示，敏感肽鍵的減少易使活性多肽被再次分解，從而失去細胞增殖能力。所以，有待增加酶解程度，驗證這一猜測。

2.1.5 不同酶解時間對細胞增殖活性的影響

圖5 不同酶解時間對SI值的影響Fig.5 Effect of hydrolysis duration on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖5可知，在底物質(zhì)量濃度一定的情況下，隨著時間的延長，并未相應提高酶解產(chǎn)物的細胞增殖活性，18h后，SI值明顯下降。由此表明，底物的酶解程度與產(chǎn)物的細胞增殖活性并未始終呈正相關，這可能與活性多肽被進一步水解，或多肽與底物蛋白的競爭性抑制[7]有關。

2.2 響應曲面試驗結(jié)果與優(yōu)化

2.2.1 響應曲面試驗結(jié)果

表2 響應曲面法優(yōu)化酶解條件的試驗設計與結(jié)果(χˉ±s,n＝3)Table 2 Experimental design and results of RSM tests(χˉ±s,n＝3)

響應曲面法的試驗設計及響應值結(jié)果如表2所示。Design Expert 7.0軟件分析刺激指數(shù)SI回歸模型的顯著性。結(jié)果顯示，模型的F值為7.67，P值為0.0002＜0.05，表明該回歸模型顯著。失擬項的P值達0.9382，說明失擬不顯著，信噪比為9.425＞4，說明此模型有較好的擬合度。根據(jù)回歸系數(shù)，可得二次多項回歸方程：SI＝ˉ1.96361＋0.074024A＋0.024035B＋0.18378Cˉ 0.012220Dˉ0.000136019ABˉ0.00332551AC＋0.00059305AD＋0.00234502BCˉ0.000115174BDˉ 0.00110592CDˉ0.000641348A2ˉ0.000899122B2ˉ 0.00545785C2ˉ0.0012695D2。回歸系數(shù)的顯著性分析結(jié)果顯示，一階主效應中的A項(P＝0.0096)，交互作用中的AC項(P＝0.0002)、BC項(P＝0.0145)，純二次項中的A2項(P＜0.0001)、B2項(P＜0.0001)、D2項(P＝0.029)均為顯著項，影響了響應曲面的彎曲性。

2.2.2 響應曲面分析與條件優(yōu)化

圖6 溫度、時間、底物質(zhì)量濃度、酶底比交互影響SI值的響應曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of hydrolysis temperature, duration, substrate mass concentration and enzyme-to-substrate ratio on SI value of small yellow croaker hydrolysate

模型的響應曲面如圖6所示，6組圖直觀反映了各因素間的交互作用。由曲面的彎曲程度和等高線的封閉情況可以看出，圖6a、c、e、f的穩(wěn)定點均落在實驗范圍里，說明最優(yōu)點的位置基本就在此范圍。圖6a所示，溫度一定時，隨著酶解時間的延長，SI值先升高后下降；時間一定時，SI值隨溫度的升高而下降。同樣，分析其余3組圖，SI值的變化趨勢與單因素結(jié)果相符，結(jié)合方程中交互項的顯著性分析，表明溫度與時間、溫度與酶底比、時間與酶底比、底物質(zhì)量濃度與酶底比的交互作用不明顯。

圖6b、d的曲面變化趨勢不完全符合單因素試驗。圖6b顯示，溫度較低時，SI值隨著底物質(zhì)量濃度的增加而上升，溫度較高時，SI值卻隨底物質(zhì)量濃度的增加而下降，同樣，在不同底物質(zhì)量濃度的情況下，SI值隨溫度的變化也不同；圖6d顯示，酶解時間較短時，SI值隨底物質(zhì)量濃度的增加而降低，時間較長時，SI值與底物質(zhì)量濃度呈正相關，另外，等高線分布顯示，不同底物質(zhì)量濃度情況下，SI值出現(xiàn)極值的時間也不同。由此證明，溫度與底物質(zhì)量濃度、時間與底物質(zhì)量濃度的交互作用明顯，即一方對響應值的影響受另一方制約。軟件對試驗的優(yōu)化結(jié)果為：溫度41.66℃、時間18.24h、底物質(zhì)量濃度6g/100mL、酶底比3.13‰，多肽產(chǎn)物的SI值為0.387。采用優(yōu)化的條件對酶解小黃魚進行重復性實驗，為方便操作，條件設為溫度42℃、時間18.2h、底物質(zhì)量濃度6g/100mL、酶底比3‰。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺激指數(shù)SI為0.369±0.003，與模型估計值0.374相比，相對誤差為0.013。

3 結(jié)論與討論

實驗結(jié)果表明，小黃魚免疫肽的酶法制備最優(yōu)工藝為底物質(zhì)量濃度6g/100mL、pH7.0、溫度42℃、酶底比3‰、時間18.2h，其中，底物質(zhì)量濃度與溫度、時間的交互作用顯著。此結(jié)論為進一步研究小黃魚免疫肽的制備工藝提供了參考。

本研究探討免疫肽的制備工藝，其實質(zhì)就是酶反應條件對產(chǎn)物活性成分的影響。蛋白酶解的機制普遍復雜，產(chǎn)物成分較多，主要受底物和酶的影響。實驗選用胰蛋白酶，其作用位點少，價格適中，且能酶切獲得免疫活性肽，屬酶解工藝中的實用酶制劑。結(jié)果分析顯示，小黃魚為底物蛋白，底物質(zhì)量濃度仍然是酶反應的主要影響因素。這與Guerard等[17]學者關于底物與酶反應的報道相符，說明底物中的敏感肽鍵及有潛力被切斷的肽鍵是控制酶反應進程的主要因素，同時也解釋了不同酶反應階段的產(chǎn)物成分差異性，繼而影響多肽產(chǎn)物的免疫活性。結(jié)合其他因素，分析交互作用可知，溫度、時間對底物質(zhì)量濃度控制酶反應進程的影響顯著，這可能與酶活力的改變有關?？傊?，在酶法制備生物活性多肽的過程中，不再追求高水解度，應以獲得目標多肽為宗旨，繼而提高酶解效率，實現(xiàn)較好的經(jīng)濟效益。

本實驗在制備多肽過程中，未先對小黃魚進行脫脂，旨在為后期探索蛋白質(zhì)與脂肪的綜合利用做基礎。然而，隨機抽取數(shù)組未脫脂樣品，考察其免疫活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SI值明顯比同等濃度的脫脂樣品小(數(shù)據(jù)未給出)，主要原因是脂肪酸及其氧化產(chǎn)生的自由基抑制細胞生長。該發(fā)現(xiàn)與潘妹霞[18]、王彩云[19]、夏延平[20]等的報道相符合，以期為相關方面的研究提供借鑒。

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Optimization of Hydrolysis Conditions for Production of Immune Peptides from Small Yellow Croaker Using Response Surface Methodology

HE Jia-yi1，XU Xin1,*，LIU Guo-yan1，CAI Li-li1，WEI Xiao-rui1，MAN Qi-qi1，LU Zheng-zhu2
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2. Lianyungang Zhengrong Food Additive Factory, Lianyungang 222000, China)

Objective: To optimize process conditions for the hydrolysis of small yellow croaker by trypsin (PTN 6.0S) to prepare peptides with high immuno-activity. Methods: the proliferative effect (expressed as stimulation index, SI) of small yellow croaker hydrolysate on mouse spleen cells was assessed by the MTT assay. Based on the index, single-factor experiments followed by response surface analysis were carried out for the optimization of hydrolysis conditions. Results: The optimal hydrolysis conditions for preparing immune peptides were hydrolysis at 41.66 ℃ for 18.24 h at a substrate concentration of 6 g/100 mL and an enzyme-to-substrate mass ratio of 3.13‰. Under these conditions, the predicted SI of small yellow croaker hydrolysate was 0.387. When the temperature, time and substrate concentration were modified as 42 ℃, 18.2 h and 3‰, the actual SI was 0.369± 0.003, which was slightly lower than the predicted value. Thus, appropriate process conditions were achieved.

small yellow croaker；immune peptides；response surface methodology；MTT assay

TS218

A

1002-6630(2012)03-0151-06

2011-05-03

江蘇省科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新資金項目(BN2008207)

何佳易(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為功能性食品資源開發(fā)與利用。E-mail：yzu.hejiayi@163.com

*通信作者：徐鑫(1977—)，男，副教授，博士，研究方向為功能性食品資源開發(fā)與利用。E-mail：xuxin@yzu.edu.cn